小檗碱和药根碱对HO诱导的PC12细胞损伤的保护作用及其机制

摘要

研究背景：
　　 阿尔茨海默病(Alzheimer's disease，AD)是一种好发于中老年人的中枢神经系统退行性疾病，是引起老年性痴呆最常见的原因，以记忆丢失和认知功能障碍为典型临床表现。其病因目前尚不清楚，大多认为是一种多病因组成的综合症。主要与淀粉样蛋白沉积、雌激素改变、炎症介质、免疫因素、自由基损伤等有关。氧化应激在神经退行性疾病中起重要作用，抗氧化是治疗神经退行性疾病的重要手段之一。开发更多天然、低毒的抗氧化剂可为神经退行性疾病治疗提供有利支持。小檗碱和药根碱是黄连的主要活性成分，对机体多种组织细胞具有抗炎、抗氧化的作用。然而，其在神经细胞氧化应激损伤中研究的较少，深入研究它的神经保护作用和机制将为神经退行性疾病的治疗提供理论依据。
　　 目的：
　　 本实验以H2O2损伤的PC12细胞作为氧化应激损伤的体外模型，探讨小檗碱和药根碱对H2O2损伤作用的影响及其机制。
　　 方法：
　　 第一部分：小檗碱对H2O2诱导的PC12细胞损伤的保护作用及其机制
　　 1)CCK-8比色法检测细胞增殖状况；
　　 2)细胞内活性氧(ROS)水平的测定；
　　 3)细胞MDA含量的测定；
　　 4)罗丹明123(Rh123)染色/流式细胞仪(FCM)检测细胞线粒体膜电位(MMP)；
　　 5)Hochest 33342染色/HCS筛选仪检测细胞凋亡。
　　 第二部分：药根碱对H2O2诱导的PC12细胞损伤的保护作用及其机制
　　 1)DPPH法测定药根碱抗氧化、清除自由基的能力；
　　 2)CCK-8比色法检测细胞增殖状况；
　　 3)细胞LDH释放、MDA含量、SOD活性的测定；
　　 4)罗丹明123(Rh123)染色/荧光显微镜摄片及流式细胞仪(FCM)检测细胞线粒体膜电位(MMP)；
　　 5)细胞内活性氧(ROS)水平的测定；
　　 6)Western blot法检测Cleaved caspase-3蛋白、HO-1蛋白的表达。
　　 结果：
　　 1.H2O2对PC12细胞的损伤
　　 1)PC12细胞分别与100μmol、200μmol、300μmol、400μmolH2O2共培养12h，CCK-8法检测细胞活力显示，在100～400μmol H2O2范围内，细胞存活率随药物浓度增加而逐渐降低，呈剂量依赖性关系。
　　 2)200μmol H2O2处理PC12细胞12h，细胞LDH释放增加、MDA含量升高、SOD活性降低。
　　 3)200μmol H2O2处理PC12细胞12h，细胞内ROS水平明显增加。
　　 4)200μmol H2O2处理PC12细胞12h，MMP明显降低。
　　 5)200μmol H2O2处理PC12细胞12h，升高HO-1蛋白表达，使caspase-3蛋白活化。
　　 2.小檗碱对H202诱导的PC12细胞损伤的保护作用及其机制
　　 1)200μmol H2O2处理PC12细胞前24h，分别给予0.05～50μmol小檗碱预处理，结果发现0.1～10μmol小檗碱可以对抗200μmol H2O2引起的细胞存活率降低；
　　 2)0.1～10μmol小檗碱预处理可减少200μmol H2O2诱导的ROS堆积；
　　 3)0.1～10上mol小檗碱预处理可以抑制200μmol H2O2引起的细胞MDA含量增高；
　　 4)1～10μmol小檗碱预处理可改善200μmol H2O2引起的MMP降低
　　 5)小檗碱预处理可对抗200μmol H2O2诱导的细胞凋亡。
　　 3.药根碱对H2O2诱导的PC12细胞损伤的保护作用及其机制
　　 1)药根碱(0.01～100μmol)对DPPH自由基的清除能力呈剂量依赖性上升；
　　 2)200μmol H2O2处理PC12细胞前24h，分别给予0.01μmol、0.1μmol、1μmol、10μmol预处理可以对抗200μmol H2O2引起的细胞存活率降低。药根碱本身(0.01～10μmol)对PC12细胞无明显的毒性作用；
　　 3)0.1～10μmol药根碱预处理可以抑制200μmol H2O2引起的细胞LDH释放；
　　 4)0.1～10μmol药根碱预处理可以抑制200μmol H2O2引起的MDA和ROS含量增加；
　　 5)0.1～10μmol药根碱预处理可抑制200μmol H2O2诱导的SOD活性降低；
　　 6)0.1～10μmol药根碱预处理可改善200μmol H2O2引起的MMP降低；
　　 7)10μmol药根碱预处理可抑制200μmol H2O2引起的caspase-3蛋白活化；
　　 8)10μmol药根碱预处理可增加抗凋亡蛋白HO-1的表达。
　　 结论：
　　 1.建立了H2O2损伤PC12细胞的体外模型，可较好地模拟氧化应激对神经元的损伤；
　　 2.小檗碱可对抗H2O2对PC12细胞的损伤作用，其机制与减轻细胞内ROS的堆积、降低MDA含量、改善MMP及抑制细胞凋亡有关；
　　 3.药根碱可对抗H2O2对PC12细胞的损伤作用，其机制与抑制LDH释放、降低细胞内MDA和ROS含量、上调SOD活性、改善MMP、及抑制凋亡蛋白的活化和增加抗凋亡蛋白的表达有关；
　　 4.小檗碱和药根碱都可以保护PC12细胞对抗H2O2诱导的细胞毒性损伤，其保护机制都与抗氧化应激损伤、改善MMP及抑制细胞凋亡等机制有关，二者在保护机制上是否存在明显不同，在今后的实验中有待于进一步探讨。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩略词

声明

前 言

材料与方法

1试剂和仪器

2试剂和药品的配制

3 PC12细胞的培养、传代与冻结

第一部分小檗碱对H2O2诱导PC12细胞损伤的保护作用及其机制

第二部分药根碱对H2O2诱导PC12细胞损伤的保护作用及其机制

结 果

第一部分 小檗碱对H2O2诱导PC12细胞损伤的保护作用及其机制

第二部分 药根碱对H2O2诱导PC12细胞损伤的保护作用及其机制

讨 论

一、H2O2损伤PC12细胞为氧化应激损伤细胞模型的建立及其特点

二、小檗碱对H2O2损伤PC12细胞具有保护作用及其可能机制

三、药根碱对H2O2损伤PC12细胞具有保护作用及其可能机制

四、小檗碱和药根碱对H2O2损伤PC12细胞保护作用有何不同?机制上有何不同?

小 结

参考文献

综述 中药治疗阿尔茨海默病的实验研究现状

致 谢