Far3p卷曲螺旋维持FAR复合物结构完整性和信息素介导的G1阻滞功能

摘要

生物为了维持基因组的稳定性和完整性必须将遗传物质准确地从母代传递到子代,因此,细胞必须保证在每个细胞周期中,DNA只能复制一次并且复制后的染色体在有丝分裂中完整地分配到子细胞中。在真核生物中,DNA复制从多个位点起始,并且需要一系列复制起始蛋白,即许可因子成功装载到复制原点上。Cdt1,是其中键的许可因子之一,在物种间通过不同的方式失活,使得在细胞周期中表达水平呈现阶段性波动。在脊椎动物,果蝇和线虫中发现有一保守的失活Cdt1的方式,也就是和Geminin相互结合。Cdt1与Geminin结合阻断了Cdt1作为许可因子的功能从而阻止DNA重复复制。但是目前在酵母中还没有发现有Geminin的同系物。
　　 为了寻找Geminin在酿酒酵母中的同系物,我们发现Geminin与CDT1相互作用的氨基酸区域的核苷酸序列(70-152残基)与Far3p(122-196残基)序列和结构上具有一定的相似性。酿酒酵母的Far3p(122-196残基)和人的Geminin(70-152残基)存在29％同源性和56％相似性,结构预测表明两个蛋白在相似的位置都有两个卷曲螺旋结构。和真核生物中的Geminin特性一致,酵母双杂交方法证明Far3p可以和Cdt1p和自身相互作用。七组分实验和染色质结合实验也说明,Far3p是一个染色体结合蛋白,在整个细胞周期中都与染色体稳定结合。但是,过度表达Far3p并不会影响细胞进程,敲除FAR3也不会导致DNA的重复复制。有可能我们的实验条件检测不到Far3p在DNA复制中可能的抑制作用。因此,目前我们还不能确定Far3p是Geminin在酿酒酵母中的同系物。
　　 本论文同时还用计算机/实验结合的方法对Far3p的自身相互作用以及卷曲螺旋结构域在维持FAR复合物的完整性中的作用进行了研究。计算机软件预测表明,Far3p含有两个卷曲螺旋结构域。我们的结果表明,Far3p通过中段与Far7p相互作用,通过N端的卷曲螺旋与Far9p和Far10p相互作用。破坏了N端卷曲螺旋的突变子同样会破坏Far3p与Far9p、Far3p和Far10p的相互作用。我们也检测到了Far3p的自身相互作用。破坏C端卷曲螺旋结构域的突变子同样破坏Far3p C端的自身相互作用。分别突变这两个卷曲螺旋结构虽然保留了部分相互作用的功能和同样的表达水平,他们两个突变在信息素作用下的G1停滞功能都会有缺陷,表明FAR3的卷曲螺旋结构域对于FAR复合物的完整性和FAR的功能必不可少。

目录

文摘

英文文摘

第一章 前言

1.1 真核生物的DNA复制

1.2 FAR复合物研究进展

第二章 FAR3与酿酒酿母GEMININ同系物鉴别分析

2.1 引言

2.2 材料

2.3 方法

2.4 结果

2.5 小结与讨论

第三章 FAR3P卷曲螺旋结构域在维持FAR复合物完整性中的作用

3.1 引言

3.2 材料与方法

3.3 结果与分析

3.4 小结与讨论

总结与展望

参考文献

附录