中国大陆EV71病毒VP1基因分子进化研究及EV71病毒样颗粒的构建

摘要

研究背景：
　　 自1957年以来,手足口病在世界多个国家爆发流行,特别是20世纪90年代以来,在亚太地区流行日益猖獗。2007年以来在中国大陆发生手足口病爆发流行,至2010年9月底,累计报告300多万感染病例,严重威胁儿童的身体健康和生命安全。手足口病的病原体主要是小RNA病毒科,肠道病毒属成员,柯萨奇A组16型(Coxsakie A16,CoxA16)和肠道病毒71型(enterovirus71,EV71)最为常见,其中EV71病毒是导致神经系统并发症和死亡病例的主要病原体。依据VP1基因核苷酸序列的差异,国内外学者将EV71分为A、B、C3个基因型,在中国大陆主要是C型。但对中国大陆EV71的长期进化情况还知之甚少；特别是病毒基因进化和变异与2007年以来中国大陆手足口病疫情之间的关系也没有得到阐明。因此,本课题收集了1987年到2009年中国大陆EV71代表毒株,分析中国大陆EV71病毒的进化及其与2007年以来手足口疫情之间的关系。
　　 目前还没有有效的疫苗用以EV71的预防,但脊髓灰质炎疫苗在控制全球脊髓灰质炎病毒传播中的成功实践,给EV71疫苗的研制带来了希望,疫苗的研究是EV71研究领域的一个热点。目前不同形式的EV71疫苗都处于研发阶段,病毒样颗粒(Virus Like Particle,VLP)疫苗是一种新型的疫苗,是通过分子生物学技术,表达病毒的一个或多个结构蛋白,这些结构蛋白具有天然的自装配能力,可形成与真正病毒颗粒相同或相似的空心颗粒,没有病毒的核酸,不能自主复制,没有感染性,表面有高密度的病毒抗原,保存了构象表位,可通过和病毒感染一样的途径呈递给免疫细胞,有效诱导机体免疫系统产生免疫保护反应。本课题在对现有EV71疫苗进行比较研究的基础上,创新性地选择毕赤酵母表达系统制备EV71病毒样颗粒,并对其免疫原性进行了研究。
　　 研究方法：
　　 1.EV71病毒VP1基因分子进化分析:对2008年广东省9株EV71病毒的VP1基因进行测序,根据分离时间和地点从Genbank中筛选了64株参考毒株,包括1987—2009年间从中国大陆和台湾分离的毒株39株,法国7株,荷兰7株,马来西亚3株,澳大利亚3株,新加坡2株,美国2株,韩国1株。甩BioEdit软件对73株毒株的VP1基因相似性得分进行了计算,用Mega4.0软件的neighbor-joining方法对73株毒株的VP1基因进行了进化分析。
　　 2.EV71病毒样颗粒构建:选择属于C6基因亚型的广东省2008年第一例死亡病例毒株(Foshan2008-FJ194964)制备病毒样颗粒,提取Foshan2008-FJ194964株病毒RNA,RT-PCR扩增P1和3CD基因,分别构建EV71 P1基因和pGAPZαA重组质粒(P1-pGAPZαA)及3CD基因和pGAPZαA重组质粒(3CD-pGAPZαA)；将3CD—pGAPZαA重组质粒电转化到SMD1168酵母细胞,构建3CD-pGAPZαA-SMD1168重组菌株；将P1-pGAPZαA电转化至3CD-pGAPZαA—SMD1168重组菌株,构建P1—pGAPZαA-3CD—pGAPZαA-SMD1168重组菌株；表达P1和3CD蛋白,及EV71病毒样颗粒；用Tricine-SDS-PAGE和Western-blot鉴定P1-pGAPZαA-3CD-pGAPZαA-SMD1168重组菌株蛋白表达；电镜观察EV71病毒样颗粒,并用Tricine—SDS-PAGE和Western-blot鉴定纯化的病毒样颗粒。
　　 3.EV71病毒样颗粒免疫原性研究:用制备的EV71病毒样颗粒免疫小鼠,测定血清中特异性IgG抗体的产生水平,体外中和试验测定免疫小鼠的中和抗体效价评价体液免疫情况；用VLP刺激小鼠脾细胞进行淋巴细胞增殖试验测定T细胞增殖情况,并测定受VLP刺激的脾细胞细胞因子分泌水平,了解所制备EV71VLP诱导细胞免疫的效果。
　　 研究结果：
　　 1.EV71病毒VP1基因分子进化:通过VP1基因进化树分析和同源性比较,发现1987年到2009年间,先后共有C2,C3,C4,C6基因亚型和A基因型EV71病毒在中国大陆流行。在20世纪80年代,中国大陆主要是C2基因亚型流行,接着是C3基因亚型,1998年开始出现C4基因亚型流行,并成为优势毒株；从2002年开始,在中国大陆出现了一种新的C6基因亚型,取代C4基因亚型成为中国大陆EV71的优势毒株。一直以来从加利福尼亚分离的CaliforniaBrCr1970-AF135885毒株是唯一的一株A基因型毒株,但2008年和2009年在安徽和湖北省分离到了A基因型毒株。VP1基因184位苏氨酸在B基因型保守；167位和282位的门冬氨酸在A基因型保守,240位苏氨酸和249位缬氨酸在C基因型保守。
　　 2.EV71病毒样颗粒的制备:扩增了P1基因,3CD基因,并分别与pGAPZαA连接,成功构建了P1-pGAPZαA和3CD-pGAPZαA重组质粒,测序鉴定重组质粒构建成功；用电穿孔仪先将3CD-pGAPZαA转入SMD1168表达菌株,得到3CD—pGAPZαA-SMD1168重组表达菌株,然后再将P1-pGAPZαA转入3CD-pGAPZαA-SMD1168重组表达菌株,得到P1-pGAPZαA-3CD—pGAPZαA—SMD1168重组表达菌株,制备了EV71病毒样颗粒。用Tricine—SDS—PAGE和Western—blot鉴定表明表达的P1蛋白成功被3CD蛋白酶切成大小分别为39KDa,36KDa和129KDa的VP0,VP1和VP3蛋白。电镜下观察看到整齐、均一的、直径约20nm的病毒样颗粒。
　　 3.EV71病毒样颗粒免疫原性评价:动物实验结果表明用VLP免疫的小鼠能产生特异性IgG抗体和中和抗体,第8周滴度达到最高,分别为211和27,16周时仍能保持较高的抗体滴度。脾细胞在VLP的刺激下发生了明显增殖,并产生了高水平的IL-2,IL-4和IFN-γ,表明诱导产生了Th1细胞免疫反应和Th2细胞免疫反应。
　　 研究结论：
　　 1.1987年到2009年间,先后共有C2,C3,C4,C6基因亚型和A基因型EV71病毒在中国大陆流行,2002年以来在中国大陆出现了一种新的EV71 C6基因型,是2007以来中国大陆的优势毒株,2008年到2009年间在中国大陆重现EV71病毒A基因型的流行。
　　 2.成功构建了P1—pGAPZαA和3CD-pGAPZαA重组质粒,两个重组质粒成功转化入同一酵母菌株,形成P1—pGAPZαA-3CD-pGAPZαA-SMD1168重组菌株,表达了3CD蛋白和P1蛋白,3CD蛋白将P1蛋白酶切为VP0,VP1和VP3蛋白,VP0,VP1和VP3蛋白成功组装成EV71病毒样颗粒。
　　 3.EV71病毒样颗粒能够激发小鼠产生特异性IgG和中和抗体,也能激发产生T细胞增殖,诱发Th1和Th2细胞免疫反应,为VLP疫苗研究奠定了坚实基础。

目录

文摘

英文文摘

第一章 前言

第一节 EV71概述

1.1 EV71流行病学

1.2 EV71病原学

1.3 临床表现

第二节 EV71分子流行病学研究

第三节 EV71疫苗研究

3.1 灭活疫苗

3.2 减毒株疫苗

3.3 亚单位疫苗

3.4 DNA疫苗

3.5 表位肽疫苗

3.6 病毒样颗粒疫苗

第四节 病毒样颗粒制备体系

4.1 表达系统

4.2 酵母表达系统

4.3 毕赤酵母表达载体

4.4 毕赤酵母载体启动子

4.5 毕赤酵母载体分泌信号

4.6 pGAPZaA载体

第二章 中国大陆EV71病毒VP1基因分子进化研究

前言

第一节 材料和方法

1.1 病例和病毒分离

1.2 RNA提取和基因测序

1.3 筛选EV71参照毒株VP1基因

1.4 同源性比对

1.5 构建系统进化树

1.6 进化树评估

第二节 结果

2.1 病例资料和病毒分离

2.2 VP1基因扩增

2.3 VP1基因系统进化分析

2.4 同源性得分

第三节 讨论

第三章 EV71病毒样颗粒的构建

前言

第一节 材料和方法

第二节 结果

2.1 P1,3CD基因PCR扩增产物

2.2 重组质粒构建及鉴定

2.4 P1-pGAPZαA SMD1168重组菌筛选

2.5 3CD-pGAPZαA SMD1168重组菌筛选

2.6 P1-pGAPZαA-3CD-pGAPZαA SMD1168重组菌Zeocine筛选

2.7 P1一pGAPZαA-3CD-pGAPZαA SMD1168重组菌PCR鉴定

2.8 重组菌Tricine-SDS-PAGE和Western-blot检测

2.9 电镜观察EV71病毒样颗粒

2.10 纯化的病毒样颗粒Tricine-SDS-PAGE和Western-blot检测

第三节 讨论

第四章 EV71病毒样颗粒免疫原性研究

前言

第一节 材料和方法

1.1 免疫原制备

1.2 小鼠免疫

1.3 体液免疫检测

1.4 细胞免疫检测

第二节 结果

2.1 总IgG滴度测定

2.2 中和抗体滴度测定

2.3 淋巴细胞增殖试验

2.4 细胞因子检测

第三节 讨论

结论

参考文献

附录

致谢