大鼠睾丸局部热作用诱导生精细胞凋亡及其分子机制的研究

摘要

背景:近年来,男性不育的原因及其相关机制受到学者们的重视。调查中发现,过去五十年中男性精子质量呈下降趋势,环境因素被认为是致病的主要因素,其中温度作为一种外在因素引起男性不育也愈来愈被重视。研究表明:包括人类在内的大部分哺乳动物的睾丸需要一个比腹腔温度低的环境,睾丸暴露在腹腔温度或高于腹腔温度可导致可复性的生精障碍和生精细胞退化,引起暂时的、部分或完全性不育,其机制尚不完全清楚,其中热作用后生精细胞的凋亡可能起了重要作用,已引起学者们关注。如对隐睾患者的研究表明,睾丸处于腹腔温度引起生精细胞的凋亡是导致隐睾患者不育的原因之一。但目前对热作用后生精细胞凋亡的研究尚不足,尤其热作用后各类生精细胞凋亡的敏感性的研究亦不统一,并且对生精细胞受热凋亡的分子机制缺乏深入研究。另一方面,在男性避孕方面的研究至今仍不理想,如广为应用的输精管结扎术因其外科手术的风险,高耗费和再通的困难都限制了它的应用。近年来,学者们致力于探索更安全、有效、可恢复的男性避孕方法。作为探索安全、有效的男性避孕途径之一,温度对精子发生的影响受到重视。所以,建立热处理的动物模型,从细胞凋亡的角度探讨热作用后生精功能变化的机理,分析凋亡相关基因的调控,将为探索和阐明男性不育的机制提供重要和有价值的资料,为临床治疗某些男性不育、加强劳动保护和探索男性避孕打下基础。
　　目的:1)研究睾丸局部热作用后生精细胞的变化,检测生精细胞的凋亡,以此阐明凋亡可作为热作用后生精细胞变化的一种机制;2)探索各类生精细胞对热的敏感性,对热作用引起生精障碍作更深入研究;3)研究凋亡相关蛋白 Fas和 FasL在热作用后生精细胞的表达情况,在分子水平上探讨热作用诱导生精细胞凋亡的机制。
　　材料与方法:雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠,分笼饲养于标准实验房(22℃),给予规律光照(12h:12h),自由饮食,随机分热处理组和对照组,热处理组按热处理后0.5、1、3、6、10、25、50和80d随机分成8个亚组(n=6),每亚组相应设立对照组(n=4)。热处理组大鼠阴囊浸于43℃恒温水浴中30min,对照组浸于22℃水浴中30min。分别在处理后0.5、1、3、6、10、25、50和80d采取标本,检测睾丸重量变化,应用 HE染色观察生精细胞组织学结构;采用电镜、流式细胞仪和原位末端标记法( TdT-mediated dUDP-X nick end labeling, TUNEL)检测睾丸局部受热后生精细胞凋亡情况;应用流式细胞仪和免疫组化法测定Fas和FasL在热作用后生精细胞的表达情况。
　　结果:
　　组织学检测:大鼠睾丸局部受热后3d出现睾丸重量明显减轻(P<0.01),热作用后以10d~25d睾丸重量减轻更严重,50d已开始恢复,但直到受热后80d睾丸重量才恢复到基本正常。光鏡下热作用后睾丸生精上皮变薄,生精细胞排列紊乱,数量减少,有大量空泡生成,出现染色质边集、呈月牙状,可见多核巨细胞。以10~25d组织学改变最明显。50d部分生精小管上皮恢复,到80d生精小管内生精上皮大多恢复正常。
　　凋亡的检测:1)电镜下热处理各组可见染色质浓缩、附着于核边缘呈新月形、核染色质固缩、断裂以及凋亡小体出现等生精细胞凋亡的表现,以热处理后0.5~6d组更常见;2)流式细胞仪观察,热处理各组均有亚单倍体细胞百分率明显增高(P<0.01),尤以0.5~6d组更明显(controls:0.5d:2.85±0.66;1d:2.36±0.57;3d:2.71±0.49;6d:2.60±0.44;experiments:0.5d:23.85±5.59;1d:30.9±1.65;3d:21.55±0.42;6d:22.98±1.53);对各类生精细胞DNA含量进行分析表明,热处理后0.5-50d组4C细胞百分比明显低于对照组(P<0.05);6d~80d组1C细胞的百分比明显低于对照组(P<0.05);3d~50d组2C细胞百分比明显高于对照组(P<0.05)。3)TUNEL检测发现,各热处理组生精细胞凋亡指数均明显增多(P<0.01),尤以0.5~6d组更明显(controls:0.5d:0.60±0.01;1d:0.55±0.06;3d:0.47±0.11;6d:0.48±0.11;experiments:0.5d:16.75±0.48;1d:27.75±0.85;3d:18±0.91;6d:16.25±1.11)。热作用后生精细胞凋亡阳性定位观察:0.5、1d组凋亡阳性主要定位在初级精母细胞;3d组出现大量的精子细胞和精子凋亡;6d、10d组凋亡细胞以大核细胞和精母细胞多见;50d组多见于精原细胞和精母细胞;80d组生精上皮大部分恢复,凋亡细胞多见于精原细胞。
　　Fas蛋白表达:流式细胞仪检测显示,热处理各组 Fas蛋白表达均明显高于其对照组(P<0.01),热处理后1d组 Fas表达最强。免疫组化染色显示:各组生精细胞、支持细胞和间质细胞均有阳性表达,热处理后各组生精细胞Fas表达均增强。
　　FasL蛋白表达:流式细胞仪检测显示,热处理后各组 FasL蛋白表达均明显高于其对照组(P<0.05),热处理后1d组FasL表达最强。免疫组化染色显示:各组生精细胞、支持细胞和间质细胞均有阳性表达,热处理后各组生精细胞FasL表达均增强。
　　结论:
　　1)热作用引起大鼠睾丸生精上皮可复性的损伤,导致生精障碍,热作用后生精细胞凋亡增加是这种生精障碍的机制之一。
　　2)各类生精细胞对热的敏感性不同,初级精母细胞热作用后最敏感,其次为精子细胞和精子,然后为精原细胞,其中精原细胞凋亡在热作用后一个较长时期内均有增加。
　　3)凋亡相关基因Fas和FasL可能参与了热作用诱导生精细胞凋亡的调控。

目录

中文摘要

英文摘要

前言

材 料 与 方 法

一、材料

二、研究方法

结果

一、热作用对睾丸重量的影响

二、热作用对睾丸组织形态学的影响

材 料 与 方 法

一、材料

二、方法

结果

一、 透射电镜检测

二、 流式细胞仪检测

材 料 和 方 法

一、材料

二、方法

结果

一、流式细胞仪检测结果

二、免疫组化染色显示：

讨论

一、局部热作用对睾丸组织影响的研究

二、局部热诱导生精细胞凋亡的研究

三、局部热作用诱导生精细胞凋亡的分子机制的研究

结论

参 考 文 献

综述

参 考 文 献

附录：硕士研究生期间发表的论文

致谢