局部高温对青春期前大鼠睾丸支持细胞的影响及其与生精细胞凋亡关系的研究

摘要

背景:
　　近几十年来人类的生殖功能不断退化,男性精子数量和质量有明显下降趋势,研究发现,世界成年男性的精子密度在过去50年里下降了近一半,平均每年下降约1％;研究表明,造成其急剧下降的因素与环境污染加剧有很大关系;近来,人们对环境干扰物、生活饮食方式及环境温度等对男性生殖功能影响的认识日益深入。大量研究证实,隐睾症患者、长期穿牛仔裤或高温作业下的青年男子的生育力出现明显下降,表明哺乳动物睾丸需要一个比腹腔温度低的适宜环境才能正常发育;温度作为一种外在因素引起男性不育逐渐受到重视;而当前临床应用的男性避孕方法如输精管结扎术等都存在不同程度的副作用,促使研究者寻找更加安全有效的方法,提高睾丸局部温度作为抗精子发生的方法则为研究男性避孕提供了一条新思路;但目前对高温引起的生精障碍机制研究仍较少。本研究采用高温处理未成年动物睾丸的模型,从细胞及分子水平探讨高温作用后生精功能障碍的机理,并对高温引起不育的机制进行深入研究;这些研究对阻止、延缓或减弱上述因素对人类生育能力的损害有重要意义,同时也为临床治疗一些男性不育、指导未成年男性生殖保健和探索男性避孕措施的研究提供理论基础。
　　目的:
　　1)研究高温对青春期前大鼠睾丸生精细胞的影响,阐明高温引起生精障碍的早期机制;
　　2)探讨局部高温诱导的睾丸支持细胞波形蛋白表达与分布改变与生精细胞凋亡间的关系,阐明支持细胞在高温诱导生精障碍中的作用;
　　3)研究睾丸生精细胞Caspase-3在高温作用后的表达分布情况,阐明Caspase-3在高温诱导生精细胞凋亡中的作用,同时探讨其与支持细胞波形蛋白分布及表达改变的关系。
　　材料与方法:
　　健康4~6周龄青春期前雄性 SD大鼠,标准实验房适应性喂养一周,给以规律光照(12h:12h)、自由进食饮水。将大鼠随机分为对照组(8只)和实验组(32只),实验组按高温处理后2、4、12和24小时均分成4个亚组(n=8)。通过对睾丸局部高温(43℃水浴15分钟)处理,对照组浸于22℃水浴15分钟于24小时后处死;分别于处理后各时间点颈椎脱臼处死,收集标本。采用组织化学和免疫组织化学方法,分析高温对青春期前 SD大鼠睾丸曲细精管细胞形态结构、支持细胞波形蛋白及生精细胞 Caspase-3蛋白表达与分布的影响,采用紫外分光光度法检测睾丸组织Caspase-3的活性;同时,应用Western blot蛋白免疫印迹技术定量检测波形蛋白表达情况;采用 TUNEL法及流式细胞仪检测各组的生精细胞凋亡情况;采用微粒子化学发光法检测各组睾丸内睾酮含量。
　　结果:
　　1.组织学观察与睾酮含量:处理后2 h即可见少量生精细胞脱落至管腔,4 h组可见大量生精细胞脱落,生精细胞与曲细精管基底膜之间形成较大空隙;12 h组可见管腔脱落细胞消失,生精上皮变薄,生精细胞稀疏、排列紊乱,支持细胞胞质呈空泡样改变;24 h损害较12 h更为严重,多数管腔可见多核巨细胞。高温作用后睾丸内睾酮含量在12 h及24 h与对照组比较均减少,其中24 h组明显下降(P<0.05)。
　　2.生精细胞凋亡情况:
　　1)TUNEL法检测:对照组可见睾丸生精上皮排列完整规则,存在较多的自发性细胞凋亡,主要集中在精原细胞及部分精母细胞;高温处理2及4h后凋亡数与对照组比较反而减少(P<0.01),各组凋亡细胞主要定位在初级精母细胞及精原细胞;12 h组生精细胞凋亡主要集中在生精周期的Ⅰ~Ⅳ期(早期)和Ⅻ~ⅩⅣ期(晚期),而Ⅴ~Ⅶ期(中期)凋亡少见;24 h组见大部分曲细精管均出现细胞凋亡,数目明显增多;12 h及24 h组凋亡指数与对照组比较明显增加(P<0.01)。
　　2)流式细胞仪检测:对照组可见凋亡峰,高温处理后2及4 h凋亡峰反较对照组下降,而在高温处理后12及24 h组,凋亡峰明显升高,甚至成为主峰;高温处理后2及4 h组亚单倍体细胞百分率与对照组比较降低(P<0.05),而12及24 h组与对照组比较明显升高(P<0.01)(Control:10.41±1.91,2 h:7.64±2.78,4 h:7.40±3.25,12 h:20.46±5.13,24 h:30.98±9.96)。且12及24 h组4C峰较前几组降低比较明显(P<0.01),2C峰变化不明显,1C峰逐渐降低。
　　3.波形蛋白(Vimentin)表达与分布情况:
　　1)免疫组化:对照组波形蛋染色可见阳性沿基底膜形成棕色的环,并随支持细胞胞质呈辐射状伸向管腔;2h组可见其围绕支持细胞核周表达,与对照组比较伸至管腔的波形蛋白微丝表达减少或消失;图像分析显示,2 h组与对照组比较蛋白表达无明显差异,而12及24 h组与对照组比较差异显著(P<0.01),4 h组较2 h组蛋白表达增加(P<0.01),4 h组与12 h组及24 h组与12 h组间蛋白表达比较无差异。
　　2)Western blot免疫印迹法:2 h组与对照组比较蛋白表达无明显差异,4 h组较对照组蛋白表达增加(P<0.05),而12及24 h组与对照组比较差异显著(P<0.01);显示各组波形蛋白表达量与免疫组织化学所得结果基本相符。
　　4. Caspase-3蛋白表达与分布及活性变化情况:高温处理后在2及4 h均可见表达,阳性细胞数逐渐增多,这时仍见大多数表达在胞浆内,主要集中在精母细胞表达,在脱落于管腔中的精子细胞核周也可见其表达;至高温处理后12及24 h,在精母细胞和精子细胞的胞核出现Caspase-3强阳性表达,图像分析显示:除2 h组与对照组比较染色阳性细胞 Caspase-3含量无差别外,其它各组均升高(P<0.05);高温处理各组阳性细胞表达率与对照组比较均增多(P<0.01),同时活性检测结果与上述基本相符。
　　结论:
　　1.高温作用可在短期内引起青春期前大鼠生精过程损伤,生精细胞凋亡增加可能是造成这种损伤的机制之一。
　　2.支持细胞波形蛋白对维持生精上皮结构的完整性有重要作用;高温可能通过直接作用支持细胞,造成支持细胞波形蛋白的表达及分布改变进而破坏生精过程,可能解释高温导致生精障碍的早期机制。
　　3. Caspase-3表达及分布的改变可能与支持细胞波形蛋白分布改变有一定联系。
　　4. Caspase-3蛋白、支持细胞波形蛋白及睾丸内睾酮含量变化三者可能在高温造成的青春期前大鼠生精细胞凋亡中具有内在联系。

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中文摘要

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前言

第一部分 局部高温对青春期前大鼠睾丸的组织形态学及睾丸内睾酮含量影响

材料与方法

结果

讨论：

第二部分 局部高温对睾丸生精细胞的影响

材料与方法

结果

讨论：

第三部分 局部高温对睾丸支持细胞波形蛋白表达及分布的影响

材料与方法

结果

讨论：

第四部分 Caspase-3在高温引起的生精细胞凋亡中的作用

材料与方法

结果

讨论：

参考文献

全文小结

附图

附录

综述

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致谢