白眉蝮蛇蛇毒中L-氨基酸氧化酶的纯化鉴定及其肺损伤的作用

摘要

背景与目的:L-氨基酸氧化酶广泛存在于蛇毒中,除外海蛇它能专一催化L-氨基酸的脱氨基作用,生成相应的α-酮酸、氨和过氧化氢。
　　蛇毒L-氨基酸氧化酶大都含有两个相同非共价结合的辅基FAD或者FMN。FAD或者FMN辅基在pH值改变或冻融过程特别容易脱离而导致酶活性的降低甚至丧失。目前对于L-氨基酸氧化酶在蛇毒中的作用还不是很清楚,目前认为该酶有抗菌、诱导水肿、溶血、出血、抗病毒、诱导细胞凋亡等活性。白眉蝮蛇主要分布在我国东北、韩国、俄罗斯,该地区毒蛇咬伤主要是白眉蝮蛇所致。目前,从白眉蝮蛇蛇毒已经分离部分组分,如磷脂酶A2(PLA2)、纤溶酶。本文从该蛇毒中分离到一个L-氨基酸氧化酶并通过SDS-PAGE测定其表观分子量约为60 kDa,通过高效液相色谱仪(HPLC)凝胶过滤测定其分子量为108.8 kDa,提示可能为同源双亚基结构。并首次系统研究了其对各种氨基酸底物的酶促动力学及其诱导的肺损伤的作用。
　　方法:通过Heparin-Sepharose FF及Q-Sepharose HP从白眉蝮蛇蛇毒中分离纯化得到一个L-氨基酸氧化酶,命名为ABU-LAO。研究了其对各种氨基酸底物的酶促动力学及不同pH条件和化合物对ABU-LAO酶活力的影响。BALB/c小鼠静脉注射50,5,0.5μg药物或生理盐水100μL,每组6只,6 h或24 h后取材,心脏、肝脏、脾脏、肾脏及肺脏组织脱水包埋,常规切片,HE染色。肺脏切片高倍镜视野下计算平均红细胞数( RBCs)、平均肺泡内多形核白细胞数(IAPLs)、平均肺泡隔多形核白细胞数(ASPLs);用图像分析仪测平均肺泡面积(MACA)。统计学处理:数据分析采用SPSS11.0软件完成。各组数据采用非参数秩和检验方法,P<0.05为有显着性差异。组内多个实验组与同一对照组比较,P<0.0125(α'=α/K, K为重复比较次数+1)为有显着性差异。
　　结果:1、通过两步层析法从白眉蝮蛇蛇毒中分离、纯化得到L-氨基酸氧化酶。通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)测定其表观分子量约为60 kDa,通过高效液相色谱(HPLC)凝胶过滤测定其分子量为108.8 kDa。L-氨基酸氧化酶约占蛇毒总蛋白质含量的1.27％。
　　2、酶促动力学研究白眉蝮蛇L-氨基酸氧化酶对L-Phe、L-Tyr、L-Leu、L-Trp、L-Ile等疏水性氨基酸活性较强,但对L-Asn的活性比对疏水性氨基酸更强,这是与其它蛇种L-氨基酸氧化酶明显不同,可能与其活性中心的细微差别有关。L-氨基酸氧化酶在不同pH条件下催化活性的变化较大。在pH4.4以下,pH10.4以上的条件下,其活性基本丧失。在pH4.8~5.6之间活性较高,酶的最高活性在pH5.2。表明在某种pH条件下时酶活性可在短时间丧失。CuSO4、ZnCl2、PMSF、叶酸、苯甲酸对酶活性有抑制作用。
　　3、肉眼观察注射生理盐水组小鼠未见任何改变。注射ABU-LAO50μg剂量作用后,6 h组6只小鼠中的2只肺脏出现明显的斑点、肿胀;24 h组6只小鼠肺脏均出现斑点,出血斑点明显较6 h组数量多、面积大、肺肿胀。5,0.5μg剂量组肺脏均未见明显改变。计量病理学分析与生理盐水组相比,RBCs、IAPLs、ASPLs、MACA在注射ABU-LAO后有显著改变(P<0.0125)。
　　结论:1、通过两步层析法从白眉蝮蛇蛇毒中分离、纯化得到L-氨基酸氧化酶。整个分离纯化过程缓冲液体系保持不变,有效避免了酶活性损失。有利于研究该酶的酶促动力学及药理学研究。
　　2、酶促动力学研究表明白眉蝮蛇 L-氨基酸氧化酶对疏水性氨基酸活性较强。可能不同蛇种 L-氨基酸氧化酶对各种氨基酸的活性表现有着种属差异性,这种差异性可能与其活性中心的细微差别有关。在某种pH条件下时酶活性可在短时间丧失。某些金属离子及化合物对酶活性有抑制作用。可能提示某些化合物抑制 L-氨基酸氧化酶的活性,不仅仅是通过影响酶本身,而且可能是通过影响底物结构的改变来实现的,比如通过影响L-氨基酸的电离状态来影响酶的活性。
　　3、ABU-LAO能引起小鼠急性出血性肺损伤,计量病理学的改变主要是红细胞及白细胞的增高,其严重程度与时间及剂量有关。白眉蝮蛇咬伤人后,局部迅速红肿、甚至皮下淤血、呼吸困难。这种现象可能与该酶所引起的损伤有关。

目录

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中文摘要

英文摘要

前言

材 料 和 方 法

一、材料

二、实验方法

1 酶的分离纯化

2 酶活性测定

3 蛋白质定量

4 SDS-PAGE及分子量测量

5. 酶促动力学研究

6 pH对L-氨基酸氧化酶活力的影响

7 金属离子与某些化合物对L-氨基酸氧化酶活力的影响

8 血小板聚集活性

9 病理学检查

10 计量病理学检测方法

11 出血活性

12 统计学处理

结果

1 酶的分离纯化

2 SDS-PAGE

3 分子量标准测量

4L-氨基酸氧化酶的酶促反应动力学

5 抑制血小板聚集活性

6 肉眼观察

7 组织学改变

8 出血活性

讨论

结论

参考文献

综述

英 文 缩 略 语

致谢

附录