铅镉联合对发育期大鼠中枢神经系统二价金属转运蛋白DMT1基因表达的影响

摘要

背景:铅、镉是环境中两种常见的重金属污染物,中枢神经系统是其毒性作用的主要靶器官之一,发育中的神经系统对铅镉尤为敏感。儿童若长期处于铅、镉污染的环境,就可能造成金属铅、镉的双重中毒,影响智力、认知能力的发育。二价金属离子转运蛋白1(divalent metal transporter1,DMT1)是哺乳动物类转铁蛋白,主要参与体内非血红素铁的转运过程。DMT1不仅介导非血红素铁的吸收,也参与多种二价金属离子的跨膜转运过程,如Mg2+、Co2+、Cd2+、Zn2+、Ni2+、Cd2+和Pb2+等,并且他们之间具有竞争性作用。Fe2+对DMT1表达的影响作用已经十分清楚,饮食缺铁可以增加脑、十二指肠和其它组织中DMT1的表达,而高铁的作用刚刚相反。这种作用是否只受铁的影响,与其转运的其它元素是否有关还未完全明了。据报道机体铁缺乏可以增加铅的毒性和负荷,在存储铁下降,尚未出现临床缺铁表现时,组织中的铅含量已经增加6倍。铅、镉中毒患者均有贫血的表现,其原因除了铅抑制血红素合成过程的酶外,DMT1表达的改变是否也参与这个过程?均需要进一步的探讨与研究。
　　目的:为了进一步揭示铅、镉的神经毒性作用机制,为预防和治疗铅镉中毒提供科学依据,研究铅镉对发育期大鼠海马、小脑、皮层组织DMT1表达的诱导作用。用乙酸铅、氯化镉溶液处理发育期大鼠,观察铅镉相互作用及DMT1 mRNA和蛋白的表达。
　　方法:24只健康的雄性一月龄SD大鼠,随机分为对照组、单铅组、单镉组、铅镉联合组,每天分别给予超纯水(对照组)、20mg/(kg·d)乙酸铅溶液(单铅组)、2mg/(kg·d)氯化镉溶液(单镉组)、20mg/(kg·d)乙酸铅和2mg/(kg·d)氯化镉溶液联合(铅镉联合组)灌胃六周。灌胃完毕后,各组大鼠断头处死,取血以石墨炉原子吸收法测血铅,血镉;剥离海马、小脑、皮层组织,左半脑提取总RNA后进行DMT1两种mRNA(+IRE与-IRE)的反转录聚合酶链反应(reverse transcriptional polymerase chain reaction,RT-PCR),反应产物进行琼脂糖凝胶电泳并扫描成像,利用凝胶自动分析成像软件Quantity One4.4.0进行灰度值分析。右半脑海马、小脑、皮层经 RIPA裂解液裂解,提取总蛋白。免疫印迹(immunoblotting)法检测 DMT1蛋白表达水平。以β- actin为内对照,求出两种 DMT1 mRNA和蛋白的相对值综合分析铅镉联合对DMT1表达的影响。
　　结果:单铅组的血铅水平与单镉组的血镉水平均显著高于对照组(P﹤0.01),单铅组的血镉水平较对照组显著升高(P﹤0.01),单镉组的血铅水平与对照组没有显著性差异(P﹥0.05),而铅镉联合染毒组的血铅、血镉水平较单染铅组与单染镉组显著升高(P﹤0.01)。各组大鼠海马、小脑、皮层组织DMT1两种mRNA均有表达,与对照组相比没有统计学差异(P﹥0.05);析因分析发现铅镉联合诱导DMT1蛋白合成有显著协同作用(P﹤0.01)。
　　结论:消化道染毒可以显著增加各大鼠的血铅及血镉水平。而且铅能促进消化道的镉吸收。镉对铅的吸收没有明显的影响作用,铅镉联合具有显著的协同效应。两种 DMT1的mRNA在发育期大鼠脑组织中均有表达,铅镉可诱导海马、小脑、皮层组织DMT1蛋白合成并且具有协同效应。上调的DMT1蛋白合成可能会影响其它多种二价金属离子转运,从而影响脑组织中各种二价金属离子的浓度平衡机制。这也可能是铅镉的神经毒性作用机理之一。

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英文缩写词

前言

材料与方法

1. 主要仪器及试剂

1.1 主要仪器

1.2 主要试剂

2. 实验方法

2. 3 血铅浓度测定

2. 4 血镉检测步骤

2. 5 RT-PCR测DMT1 mRNA表达量

2.6 Western blot测各脑区DMT1蛋白表达

结果

1. 石墨炉原子吸收法测各组大鼠血铅镉水平

2. 铅镉暴露对大鼠脑组织DMT1 mRNA表达的影响

3. 铅镉水平对大鼠脑DMT1蛋白合成的影响

讨论

1. 铅镉暴露动物模型的建立

2.发育期大鼠铅镉暴露与神经系统的损伤

结论

参考文献

文献综述

参考文献

个人简历

读研期间发表论文

致谢

附录1 主要实验试剂配制