苯妥英钠对C57BL/6胚鼠颅面组织中Satb2和H 0xa2基因表达的影响

摘要

背景与目的:
　　面部的发生是由一系列复杂的过程所组成,包括神经嵴细胞的增殖、迁移、分化、细胞外基质的产生和细胞凋亡等。到目前为止,己知越来越多的基因在此过程中起重要作用,常见的有TGFcu TGFp3、MsxK IRF6等.在这个过程中任何外界致畸因子的作用或某些自身基因表达异常都有可能引起颅面畸形的发生,最常见的是先天性唇腭裂畸形。苯妥英钠是研究较多的一个致畸因子,但关于苯妥英钠引起唇腭裂机制的研究存在很多的不同点。现阶段主要有两种说法,一种是由于活化前列腺素H合成酶(prostaglandin H synthase, PHS),引起胚胎蛋白质和DNA的氧化损伤;另一种是苯妥英钠引起Hoxa2mRNA低表达导致腭突融合障碍。SATB2基因是最近发现的与人面部发生密切相关的一个基因,小鼠Satb2基因特异性表达于上颌突、额鼻突和逐渐形成的腭骨架的内侧,Satb2基因可以抑制H ox家族基因包括Hoxa2基因的表达。这就说明苯妥英钠与Satb2基因在唇腭裂发生过程中可能存在相互作用。本实验运用TaqM an探针技术行实时定量PCR,研究苯妥英钠对C57BL/6系胚鼠颅面组织中Satb2和Hoxa2基因mRNA表达的影响,探讨苯妥英钠在唇腭裂发生过程中可能作用机制,为寻找苯妥英钠引起唇腭裂的预防措施提供参考依据。
　　方法:
　　1.孕 C57BL/6小鼠30只,随机分为苯妥英钠组(PHT)、生理盐水对照组(NS),再按受孕时间的不同分为GD11.5(Gestation Day, GD)、GD12.5和GD13.5组,每组各5只。
　　2. PHT组小鼠在孕第10天腹腔注射苯妥英钠(溶解于生理盐水中,65 mg/kg),对照组腹腔注射生理盐水(10 ml/kg)。分别在GD11.5、GD12.5和GD13.5断颈处死孕鼠,解剖显微镜下分离胚鼠颅面组织。
　　3.异硫氰酸胍-酚-氯仿法提取组织总RNA,琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度法鉴定RNA的完整性及纯度。
　　4. DNase处理RNA样本,然后行逆转录法合成第一链cDNA。
　　5.运用TaqMan探针技术行实时荧光定量PCR,检测Satb2和Hoxa2基因表达量的变化。
　　结果:
　　1. Satb2和Hoxa2基因在正常胚鼠发育第11.5天到13.5天的颅面组织中均有表达。Satb2基因相对表达量分别为14.022、40.33、66.412; Hoxa2基因相对表达量分别为1.682、5.87、1.337。不同时点的表达量有显著性差异。
　　2.与对照组相比,PHT组相应时点Satb2基因表达量明显低于NS组(P<0.01); Hoxa2基因的表达量则高于对照组(P<0.01)。
　　结论:
　　Satb2和H oxa2基因在胚鼠唇腭发生的关键时期有表达,进一步证实Satb2和Hoxa2基因是小鼠唇腭发生中的重要基因。Satb2和H oxa2基因在不同时点的表达量有显著性差异。从胚鼠发育第11.5天到13.5天,Satb2基因在颅面组织的表达量中逐渐升高;Hoxa2基因表达量先升高后降低。苯妥英钠作用的C57BL/6孕鼠其胚鼠颅面组织中Satb2基因表达量明显下降,H oxa2基因表达量相对升高;苯妥英钠可能通过调节Satb2和H oxa2基因的表达引起唇腭裂。

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第 1章前言

第2 章材料与方法

2.1 材料来源

2.1.1 动物来源

2.1.2 主要试剂

2.1 . 3 仪器与设备

2.1.4引物与荧光探针合成

2.1.5试剂配制方法

2. 2实验步骤

2. 2. 1—般情况

2.2.2实验分组

2. 2. 3标本米集

2. 2. 4总RNA提取

2. 2. 5 DNase处理总 RNA

2. 2. 6逆转录合成cDNA第一链

2.2.7 PCR检测cDNA样本

2.2.8实时荧光定量PCR

2. 3统计学处理

第3 章结果

3.1 RNA纯度及完整性分析

3. 2 RT-PCR

3. 3实时荧光定量PCR对样品的测定

第4 章讨论

4. 1面部的发生与先天性唇腭裂畸形

4 .2 苯妥英钠与先天性唇腭裂畸形

4.3 Satb2和Hoxa2基因与先天性唇腭裂畸形

第5 章结论

第6章展望

参考文献

综述

致谢

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