DES及INSL3对体外培养小鼠睾丸引带细胞中LGR8转录和表达的影响

摘要

目的:
　　近年来研究表明环境雌激素(EEs)对男性生殖系统的影响日益明显,且大多数与睾丸的下降不全及发育不良有关,而睾丸引带在睾丸的下降和发育过程中一直被认为扮演着重要角色。研究证实胰岛素样因子3(INSL3)参与引带发育、睾丸下降的过程。INSL3通过与其特异性受体LGR8结合而在第一阶段(经腹下降期)发挥主要作用,且LGR8高表达于睾丸引带之上,但有关其具体作用机制尚未完全研究清楚。本实验通过体外培养小鼠睾丸引带细胞,利用不同浓度己烯雌酚(DES)和INSL3直接作用于培养的小鼠睾丸引带细胞,以探讨DES和INSL3对小鼠睾丸引带细胞中LGR8 mRNA及蛋白表达的影响及其与小鼠睾丸下降的可能关系。
　　材料与方法:
　　将刚出生3日龄的雄性昆明小鼠显微剖出其睾丸引带组织并进行细胞培养。传代培养后随机分组,按DES浓度分为10μg/ml、1μg/ml、0.1μg/ml、0.01μg/ml、DMSO溶剂对照组和正常对照组;按INSL3浓度分为20ng/ml、2ng/ml、0.2ng/ml、0.02ng/ml和正常对照组。在倒置显微镜下观察细胞形态并应用免疫荧光对LGR8进行亚细胞定位。加药持续作用48h,用Trizol法提取总RNA,紫外分光光度法和琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA纯度及完整性。然后应用RT-PCR分析不同浓度DES及INSL3作用后小鼠睾丸引带细胞中LGR8 mRNA的表达情况。将药物作用48h后的细胞收集制成细胞悬液,通过流式细胞术分析小鼠睾丸引带细胞中LGR8蛋白的表达水平。
　　结果:
　　1.体外培养的小鼠睾丸引带细胞大部分为成纤维样细胞,有少数的上皮样细胞。胞体呈梭形或不规则三角形,胞质有突起。传代后细胞仍呈成纤维细胞型生长,同源性好,存活率约90％。高剂量DES作用48h后细胞失去成纤维型形态,胞浆收缩,胞体呈不规则类椭圆型。
　　2.细胞免疫荧光方法发现LGR8表达于细胞膜上,且表达较高。
　　3. DES各实验组与正常组相比,10μg/ml组睾丸引带细胞LGR8 mRNA及蛋白表达水平升高(P<0.01),1μg/ml、0.1μg/ml、0.01μg/ml组表达下降(P<0.01或P<0.05),DMSO组LGR8 mRNA及蛋白水平的表达均无显著性差异( P>0.05)。
　　4. INSL3各实验组中0.02ng/ml组睾丸引带细胞LGR8 mRNA及蛋白水平的表达高于正常对照组(P<0.01),20ng/ml、2ng/ml、0.2ng/ml组与正常组相比均无显著性差异(P>0.05)。
　　结论:
　　1.体外培养小鼠睾丸引带细胞呈成纤维细胞型生长,传代后细胞同源性好,存活率高。大剂量DES可导致小鼠睾丸引带细胞形态异常、结构紊乱。
　　2.免疫荧光确认LGR8在睾丸引带细胞膜上表达,且表达较高。
　　3.高剂量的DES可使睾丸引带细胞中LGR8的表达水平升高。
　　4.极低剂量的INSL3能上调睾丸引带细胞中LGR8的表达量。
　　5.实验证实高剂量的DES和极低剂量的INSL3均可使睾丸引带细胞中LGR8的表达水平上升,又因高剂量的DES和极低剂量的INSL3都与睾丸下降不全有关,继而推测DES和INSL3可能通过LGR8作用途经来影响睾丸引带的发育。

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主要缩略语中英文对照表

目录

第一章 前 言

第二章 实验技术路线

第三章 材料与方法

1. 材料

2. 方法

3. 统计学处理

第四章 结 果

1. 小鼠睾丸引带细胞培养及DES对其形态的影响

2.免疫荧光染色

3. RT-PCR

4. 流式细胞术（Flow CytoMeter，FCM）

第五章 讨 论

1. 睾丸引带和睾丸下降的关系

2. DES与睾丸引带发育的影响

3. INSL3与LGR8

4. 免疫荧光对LGR8亚细胞定位

5. DES/INSL3对睾丸引带细胞中LGR8 mRNA及蛋白表达的影响

第六章 结 论

参考文献

综述一：发表于中国男科学杂志.

参考文献

综述二：发表于中华男科学杂志.

参考文献

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