mmu-miR-335与小鼠精子活力及受精能力关系的研究

摘要

在我国每年出生的约2000万婴儿中，神经管畸形、先天性心脏病、唇腭裂等先天残疾儿童数高达80万～120万，约占每年出生人口总数的4％～6％。其中大多数出生缺陷属于多因素疾病，受遗传因素和环境因素的共同影响。然而，出生缺陷的病因学及发病机理至今尚不完全清楚。最新研究发现，机体某些结构和功能的变化，乃至疾病的发生，并非基因本身发生了改变，而是基因的表观遗传修饰发生了变化，其中微小RNA（miRNA）在基因表达和调控中扮演着重要角色，miRNA可调控生殖细胞的减数分裂，影响配子的生长发育，参与植入前胚胎早期发育时序的调节，干预植入过程中相关基因的表达。本研究通过构建mmu-miR-335过表达及沉默质粒，脂质体法转染昆明小鼠精子后，研究mmu-miR-335对精子活力、精卵结合及受精能力的影响。
　　【材料和方法】
　　1.材料：（1）CMV/GFP/Neo质粒；（2）293T细胞；（3）精子，取自性成熟的雄性健康昆明小鼠；（4）卵母细胞，取自性成熟的雌性健康昆明小鼠。
　　2.方法：（1）mmu-miR-335过表达和沉默质粒构建：用酶切、PCR和基因测序3种方法鉴定重组质粒是否构建成功；（2）细胞培养及转染：观察绿色荧光蛋白的表达，检测mmu-miR-335过表达和沉默质粒能否在真核细胞中表达；（3）荧光原位杂交：设计5’端FITC标记的mmu-miR-335探针，oligo合成，定位miR-335在成熟精子中的位置；（4）精子活力检测：脂质体法转染小鼠精子mmu-miR-335过表达及沉默质粒后显微镜下镜检精子活力；（5）精卵吸附实验：洗涤后的昆明小鼠精子，于获能培养基中转染mmu-miR-335过表达及沉默质粒1 h后，体外受精，受精1 h后吸取卵母细胞压片，计数卵母细胞周围吸附精子数。对照组一为未经质粒转染的正常精子，对照组二为转染空载体精子组；（6）体外受精：洗涤后的昆明小鼠精子，于获能培养基中转染mmu-miR-335过表达及沉默质粒1 h后，与正常促排卵卵子进行体外受精，24 h后计算受精卵得率。对照组一为未经质粒转染的正常精子，对照组二为转染空载体精子组。
　　【结果】
　　1．酶切、PCR和基因测序结果表明mmu-miR-335过表达及沉默质粒成功构建；
　　2．将mmu-miR-335过表达质粒及沉默质粒分别转染293T细胞，48小时后见绿色荧光蛋白的表达，说明所构建质粒可正常表达；
　　3．荧光原位杂交见精子赤道部核周隙出现mmu-miR-335杂交信号；
　　4．转染mmu-miR-335过表达及沉默质粒后，昆明小鼠精子活力无显著性差异；
　　5．转染mmu-miR-335过表达及沉默质粒后，昆明小鼠精子精卵结合能力无显著性差异；
　　6．转染mmu-miR-335过表达及沉默质粒的精子与卵子体外受精后，受精卵得率无显著性差异。
　　【结论】
　　1．成功地构建了mmu-miR-335过表达及沉默质粒；
　　2．mmu-miR-335过表达及沉默质粒可以在真核细胞中表达；
　　3．可在精子赤道部核周隙检测到mmu-miR-335的位点，表明mmu-miR-335在成熟精子中位于细胞质中；
　　4．mmu-miR-335过表达及沉默质粒对精子活力无显著性影响；
　　5．mmu-miR-335对精子精卵结合的能力无明显影响；
　　6．mmu-miR-335对精子受精能力无显著性影响。

目录

封面

声明

中文摘要

英文摘要

主要缩略语中英文对照表

目录

前 言

技术路线

材料与方法

1 材料

2 方法

结果

1.mmu-mir-335过表达及沉默质粒的构建与鉴定

2.重组质粒目的基因的表达检测

3.mmu-miR-335荧光原位杂交

4.mmu-mir-335靶基因

5. 转染1 h后精子的活力及活率

6.卵母细胞吸附精子数

7 受精率

讨 论

全文小结

后期实验计划

参考文献

附 录1：主要混合液及培养基

附 录2：测序结果

致 谢

综 述

1 有关精子RNA的的争议

2 精子RNA的种类与定位

3 精子RNA的功能

4 小结与展望

参考文献：

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