4℃冷藏小鼠附睾精子与OPS法冷冻卵母细胞体外受精能力的研究

摘要

本实验主要目的是探索不同方法低温(4℃)冷藏的小鼠附睾精子与新鲜/OPS法冷冻·解冻的卵母细胞的体外受精能力，并进行卵母细胞透明带打孔来提高体外受精率，通过胚胎移植及体外培养检验胚胎的体内、外发育能力。 实验一比较屠体法和混合气(5％CO2、5％O2和90％N2，以下同)法保存的精子同新鲜卵母细胞体外受精的能力。结果表明，处理组与对照组在2-细胞率、桑椹胚率、囊胚率均有显著性差异(P＜0.05)。比较两种冷藏方法，屠体冷藏1、2天的精子与卵母细胞受精后囊胚率(64.29％,46.23％)与混合气法同等天数处理组的囊胚率(53.55％,37.63％)无差异性显著(P＜0.05)；然而，对于冷藏3、4天的精子，混合气法处理的精子同卵母细胞受精后在卵裂率(41.41％vs16.22％；25.97％vs15.83％)及囊胚发育率(21.21％vs13.51％；14.92％vs5.00％)均高于屠体法同等处理组，且有显著性差异(P＜0.05)。 由于混合气法在第3、4天保存精子的效果优于屠体法，故实验二、三、四处理组均采用混合气法保存的精子。实验二表明卵母细胞透明带打孔技术能够提高活力较弱精子与新鲜卵母细胞的体外受精能力。结果表明，冷藏1、2天的附睾精子与卵母细胞(ZD)的受精率(91.19％，86.59％)及囊胚率(83.65％，76.22％)与新鲜精子组(91.94％，84.68％)均无显著性差异(P＞0.05)。而且，冷藏天数(1～4)相同的精子，卵母细胞透明带打孔处理组同非打孔组相比，其体外受精率都是前者高于后者(P＜0.05)。 实验三探讨冷藏精子与冷冻卵母细胞的体外受精能力。利用OPS法玻璃化冷冻保存小鼠卵母细胞，解冻后其形态正常率为85％左右。若直接与新鲜的精子进行体外受精，受精率相对较低(46.67％)，但通过对卵透明带打孔后受精率可以大大提高(84.73％)。即使是冷藏1～3的精子与解冻卵母细胞(ZD)体外受精后其受精率(分别为79.58％，80.80％，67.57％)仍高于新鲜精子与解冻后的卵母细胞(ZI)的受精率(46.67％)，且差异性极显著(P＜0.01)。在同等条件下，对冷冻卵母细胞透明带进行打孔，冷藏1、2天的精子与卵母细胞的受精率(79.58，80.80％)与新鲜精子组的受精率(84.73％)差异不显著(P＞0.05)。但对于冷冻/解冻卵母细胞，无论透明带打孔处理与否，体外受精后的囊胚发育率均低于新鲜卵母细胞处理组(P＜0.01)。 实验四对上述部分处理组2-细胞胚胎进行移植，检验胚胎在体内的发育。结果表明：新鲜精子与新鲜卵母细胞(ZD/ZI)受精后2-细胞移植，产仔率分别为46.30％和50.00％，且差异不显著(P＞0.05)；新鲜和解冻卵母细胞透明带打孔后与新鲜精子受精，2-细胞移植后产仔率分别为46.30％和16.44％，差异极显著(P＜0.01)；新鲜卵母细胞打孔后分别与新鲜精子与冷藏两天精子受精，2-细胞移植产仔率分别为46.30％和21.43％，且有显著性差异(P＜0.05)。以上各组囊胚细胞数均无显著性差异(P＞0.05)。

目录

文摘

英文文摘

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第一部分文献综述

第二部分研究论文

结论

参考文献

致谢

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