碘化 N-正丁基氟哌啶醇抑制机械损伤诱导血管平滑肌细胞增殖的作用及机制研究

摘要

术后再狭窄是临床上血管手术后常见的现象。术中对血管细胞的损伤及血管壁完整性的破坏是导致再狭窄的始动因素。中膜平滑肌细胞增殖在此病理过程中具有重要作用，而丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路和下游效应因子早期生长反应因子-1(Egr-1)可能涉及细胞损伤后增殖过程。碘化N-正丁基氟哌啶醇(F2)是本实验室合成的一种新型的氟哌啶醇衍生物，具有心肌保护作用。本研究在体外建立机械损伤致血管平滑肌细胞(VSMCs)增殖模型，探讨其可能的分子机制，并研究F2对VSMCs损伤后增殖的作用及相关机制。
　　目的：
　　探讨机械损伤致血管平滑肌细胞(VSMCs)增殖的分子机制以及碘化 N-正丁基氟哌啶醇(F2)对其作用及相关机制。
　　方法：
　　1 Sprague-Dawley大鼠胸主动脉平滑肌细胞体外培养：采用组织块贴壁法。
　　2 Sprague-Dawley大鼠胸主动脉平滑肌细胞鉴定：采用免疫细胞化学方法加以鉴定。
　　3体外机械损伤模型的建立：采用划线法，损伤培养细胞。
　　4 CCK-8法检测VSMCs增殖情况。
　　5流式细胞仪(FCM)观察分析VSMCs细胞周期分布特征的改变。
　　6 Western-blot方法测定VSMCs中p-/-MEK，p-/-ERK，p-p38/JNK，Egr-1蛋白水平。
　　7 Real time RT-PCR方法测定VSMCs中MEK和Egr-1 mRNA表达水平。
　　8 MEK siRNA转染VSMCs，观察细胞中的p-/-MEK、p-ERK和Egr-1蛋白及其mRNA的表达变化。
　　结果：
　　1原代培养4～7天左右可见组织块周围有细胞长出，2～3周达亚融合，传代后细胞“峰、谷”状生长明显。
　　2SM actin免疫细胞化学染色阳性。
　　3 CCK-8检测结果显示机械损伤模型组VSMCs有显著增殖(P<0.01)，而F2剂量依赖地抑制损伤后VSMCs增殖。
　　4机械损伤后，G0/G1期的细胞比例减少, S期和G2/M期细胞比例增加；F2可显著抑制损伤后S期和G2/M期细胞比例的升高，增加G0/G1期细胞的比例，有效阻止细胞进入S期。MEK抑制剂pd98059和U0126也均具有同样作用效果，即抑制损伤后细胞周期的改变。
　　5与Control组相比，机械损伤后VSMCs中p-MEK/ERK蛋白有明显升高，在5～10 min表达最高，p-p38/JNK未见明显变化，MEK/ERK蛋白表达基本不变。MEK mRNA表达量在损伤后升高，2.5 h达到高峰。
　　6机械损伤后VSMCs中Egr-1蛋白及其mRNA表达明显升高。Egr-1蛋白在损伤1 h后表达明显升高，2 h达高峰，此后逐渐下降。Egr-1 mRNA在损伤后1 h内合成量较高，其中在45 min表达量最高。
　　7 MEK抑制剂pd98059和U0126可以明显抑制损伤后p-MEK/ERK和Egr-1蛋白及其mRNA表达升高。
　　8与模型组比较，MEK siRNA干扰后可降低损伤后VSMCs中p-MEK/ERK、MEK和Egr-1蛋白以及MEK和Egr-1 mRNA的过度表达。
　　9 F2可以剂量依赖地抑制机械损伤后VSMCs中p-MEK/ERK和Egr-1蛋白及其mRNA的过度表达。
　　结论：
　　体外机械损伤可致血管平滑肌细胞增殖，其分子机制可能与MEK/ERK/Egr-1信号通路途径有关；碘化N-正丁基氟哌啶醇抑制机械损伤所致的VSMCs增殖，其机制可能是通过抑制MEK/ERK/Egr-1信号途径来实现的。

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目录

第1章 前 言

第2章 材料和方法

2.1 实验材料

2.2 实验方法

第3章 结 果

3.1 血管平滑肌细胞(VSMCs)

3.2 机械损伤刺激致VSMCs增殖作用及机制

3.3 F2对机械损伤致VSMCs增殖的作用及机制

第4章 讨 论

第5章 结 论

参考文献

附 录

论文综述

1 血管平滑肌细胞增殖与炎症

2 血管平滑肌细胞增殖的信号转导通路

3 血管平滑肌细胞增殖的临床药物治疗

参考文献

个人简历

致谢