大鼠肌源性干细胞的分离、培养、鉴定及分离方法的比较

摘要

目的：
　　通过不同的方法分离肌源性干细胞、然后对其培养、鉴定,并比较肌源性干细胞表面抗原Sca-1的阳性率,寻找分离肌源性干细胞的理想方法,为下一步进行生长因子基因转染的肌源性干细胞注射治疗压力性尿失禁的动物实验奠定基础。
　　方法：
　　根据消化酶添加的顺序及消化时间的不同,本实验采用常见的4种消化分离法从4-6周龄SD大鼠大腿分离肌源性干细胞,差速贴壁法纯化,通过流式细胞仪、细胞免疫荧光技术进行鉴定,并比较不同方法获得的肌源性干细胞Sca-1的阳性率。
　　此4种消化分离方法是:
　　1、方法一:将适量骨骼肌组织碎块一次性放入Ⅰ型胶原酶、Ⅳ型胶原酶、DispaseII及胰酶的混合酶中消化;
　　2、方法二:将适量骨骼肌组织碎块首先放入Ⅰ型胶原酶和Ⅳ型胶原酶的混合酶中消化,再用DispaseII和胰酶的混合酶消化;
　　3、方法三:将适量骨骼肌组织碎块放入Ⅰ型胶原酶和Ⅳ型胶原酶的混合酶中消化,然后用DispaseII、胰酶分别消化;
　　4、方法四:将适量骨骼肌组织碎块按先后顺序依次添加Ⅰ型胶原酶、Ⅳ型胶原酶、DispaseII及胰酶进行消化;
　　结果：
　　不同的方法分离出的肌源性干细胞,流式细胞仪鉴定CD34、CD45及Sca-1抗体的阳性率分别为35.27％、5.24%及58.92%,细胞免疫荧光desmin抗体阳性;方法一、方法二、方法三及方法四分离培养的肌源性干细胞Sca-1平均阳性率不同,差别具有统计学意义(P=0.000<0.05),分别为46.5%±16.11%、50.95%±13.46%、55.38%±7.19%及71.58%±2.32%;方法一、方法二、方法三分离培养的肌源性干细胞Sca-1抗体的阳性率明显低于方法四分离培养的肌源性干细胞(P=0.000<0.05),差异具有统计学意义。
　　结论：
　　不同的方法消化大鼠骨骼肌均可获得肌源性干细胞,但其纯度各异;消化酶之间的相互作用影响肌源性干细胞的纯度,单酶分步消化能提高肌源性干细胞纯度,方法四可作为本科研组肌源性干细胞的分离方法,分离高纯度的肌源性干细胞,用于下一步生长因子基因转染的肌源性干细胞注射治疗压力性尿失禁的动物实验研究。

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第1章 前言（背景）

第2章 材料与方法

2.1 实验动物及实验器材

2.2 主要试剂

2.3 骨骼肌细胞的消化分离

2.4 肌源性干细胞的纯化

2.5 肌源性干细胞的鉴定

2.6 肌源性干细胞的生长曲线

2.7 肌源性干细胞不同分离方法的比较

2.8 统计学处理

第3章 实验结果

3.1 细胞形态及肌管形成

3.2 肌源性干细胞(MDSCs)鉴定结果

3.3 肌源性干细胞(MDSCs) 生长曲线图

3.4 不同分离方法的肌源性干细胞Sca-1阳性率

第4章 讨论

第5章 总结

参考文献

综述

参考文献

致谢

攻读学位期间完成论文

个人简历

统计学证明