新生大鼠骨骼肌肌源性干细胞的分离、纯化、培养和鉴定

摘要

目的:肌源性干细胞(musclederived-stemcells，MDSCs)移植治疗压力性尿失禁(SUI)的研究深受关注，传统的治疗方法长期疗效不理想且并发症多，随干细胞研究的深入，干细胞移植成为肌肉组织损伤修复的一种重要手段，同时也为SUI的根本治疗带来希望。其中MDSCs倍受关注，它是肌肉中一种高度未分化的多潜能干细胞，具有体外分裂增殖快、自我更新、多向分化潜能和移植后存活率高等特点。并且取材资源丰富，操作方便，安全性高，是一种理想的种子细胞。由于肌肉组织中MDSCs数量少，所以MDSCs的分离和体外培养是进行移植的关键。本实验运用改良酶消化法和差速贴壁法分离纯化出MDSCs，通过细胞免疫组织化学染色进行鉴定，并对其体外培养进行密切观察，掌握稳定的分离纯化和培养方法，为将来移植治疗SUI提供重要的实验依据。
　　 方法:
　　 1骨骼肌细胞的消化分离:实验动物为清洁级新生SD(Sprayue-Dawley)大鼠，雌雄不限。75％酒精浸泡窒息处死后，取下四肢骨骼肌并剪成碎块（约1mm3），PBS缓冲液吹打冲洗，静置后去除上清液，加入约2倍体积的混合酶（2.4u/mlDispaseⅡ、0.5％Ⅰ型胶原酶，2.5mmol/LCaCl2），37℃水浴箱消化约1小时，加入生长培养基终止消化，过滤后离心弃上层液，重悬细胞后进行培养(37℃，5％CO2)。
　　 2MDSCs的分离、纯化和培养:培养2小时后贴壁细胞记为PP1，将上层液中未贴壁的细胞吸出后继续培养。24小时后，贴壁细胞记为PP2。每24小时进行差速贴壁培养，直到获得PP6。PP6培养3天后换液，每2～3天换液1次，待70～80％融合后传代培养。用0.25％胰蛋白酶消化细胞，加入胎牛血清终止消化，按1∶2的比例进行传代培养。
　　 3MDSCs生长曲线的测定:取MDSCs传代培养的一代、四代和七代细胞，0.25％胰酶消化后，以3×104个/ml的密度接种于24孔培养板，每日随机选取3孔进行细胞计数，共记录8日，取平均值绘制细胞生长曲线。
　　 4MYY比色法观察不同接种密度对MDSCs生长的影响:取MDSCs传代细胞，调节细胞密度分别为2、4、6、8、10、12、15×105个/ml，接种于96孔培养板中，培养48小时后，每孔加入20ulMTT(5mg/ml)，37℃避光培养4小时后弃上清液，每孔加入100ul二甲基亚砜(DMSO)，振荡10分钟使结晶物完全溶解，在490nm处检测吸光度值。
　　 5MDSCs的鉴定:对获取的MDSCs(PP6)以及MDSCs传一代、四代、七代进行Desmin、Sca-1抗体免疫细胞化学染色，对PP1～PP6进行Desmin免疫细胞化学染色，以成纤维细胞作为阴性对照，在显微镜下观察，以胞膜和/或胞浆内出现棕黄色颗粒判定为阳性，每组选取不同的视野进行计算阳性细胞占细胞总数的百分比。
　　 6统计学处理:使用SPSS13.0统计软件处理实验数据，并进行统计学分析，P＜0.05认为有统计学意义。
　　 结果:
　　 1MDSCs的消化、分离、纯化和细胞形态
　　 骨骼肌经过混合酶消化后得到肌纤维碎片、骨骼肌细胞、血细胞、成纤维细胞和内皮细胞等的混合物，用差速贴壁法将快速贴壁细胞与慢速贴壁细胞逐步分离，便可获得MDSCs。PP1、PP2以成纤维细胞为主，细胞数量多，贴壁迅速，增殖快，5天左右完全融合;PP3、PP4以肌细胞为主，数量减少，增殖较快，1周左右完全融合;PP6贴壁的细胞数量明显减少，多为小圆形或梭形，体积较小，折光性好，增殖缓慢，另有少量悬浮的细胞。培养72小时后细胞数量增多，呈现梭形或纺锤形，有小克隆团形成，分散生长在瓶底。1周左右细胞明显分裂增殖，数量增多，密度增加，形成众多细胞团，呈簇状生长，细胞簇之间有明显的界限，贴壁细胞展开生长呈梭形、纺锤性或多角形，细胞质少，胞核增大。10天左右细胞继续增殖，呈长梭形，细胞之间相互融合，细胞簇体积增大并相连成片，细胞间隙变小。
　　 2MDSCs传代细胞的生长曲线
　　 生长曲线呈现S形，经过滞留期、对数生长期和平台期。培养2天内细胞分裂扩增不明显，生长速度较慢;3天后细胞扩增明显，生长速度加快，进入对数生长期;6天后细胞增殖受到抑制，生长变慢，进入平台期。传第一代细胞增殖速度快于传四代和七代细胞，同时随传代次数增多，细
　　 3不同接种密度对MDSCs生长的影响
　　 在一定细胞数范围内，吸光度数值与细胞数成正比。在1×106个/ml密度接种时吸光度值最大，细胞数量最多，活性较好，有利于细胞的生长和传代培养。
　　 4MDSCs的鉴定
　　 MDSCs对Desmin和Sca-1免疫细胞化学染色均呈阳性表达，光镜下胞膜胞浆呈现棕黄色，成纤维细胞呈阴性反应。PP1～PP6中Desmin的阳性表达率逐渐升高，PP6中两者阳性表达率均在90％以上。MDSCs传一代、四代和七代的细胞中均对Desmin和Sca-1均呈阳性表达，表达率均在80％以上。
　　 结论:
　　 通过改良混合酶消化法和差速贴壁技术(preplate)，可以获得新生SD大鼠的MDSCs，传三代内的MDSCs分裂增殖显著，细胞活性较好，生长速度较快，在合适的接种密度和培养条件中细胞分裂增殖最好，可获得较多数目的细胞，Desmin和Sea-1可以鉴定MDSCs，传至第七代的细胞仍保持较高的活性。

目录

声明

摘要

前言

材料与方法

1 实验动物、主要试剂及仪器

2 实验方法

结果

1 MDSCs的消化、分离和纯化过程中细胞形态的观察

2 MDSCs传代细胞的生长曲线

3 接种密度不同对MDSCs生长的影响

4 MDSCs的鉴定

附图

附表

讨论

一、MDSCs的分离、培养

二、MDSCs的体外培养

三、MDSCs的鉴定

结论

参考文献

综述

致谢

个人简历