红球菌P14降解类固醇激素及其相关基因的初步研究

摘要

在众多的环境内分泌干扰物中,类固醇激素的干扰活性最强,并且难以降解可以长期存在环境中,对人类健康造成极大危害因而受到社会的广泛关注。微生物降解是去除类固醇激素污染的一种非常有效方法。本论文以类固醇激素为研究对象,选择实验室前期分离的一株具有浮起至油层的性质且能降解多环芳烃的海洋菌Rhodococcussp.P14为研究菌株,基于全基因组测序的生物信息学分析结果,主要研究菌株对类固醇激素降解能力、降解的中间代谢产物检测及降解相关的功能基因的表达验证,探讨菌株降解类固醇激素的机制。本文研究的主要结果如下:
　　红球菌P14对100μg/mL卡那霉素不敏感;对100μg/mL羧苄青霉素、50μg/mL四环素、100μg/mL氨苄青霉素、170μg/mL氯霉素、50μg/mL链霉素敏感。菌株能够在0％到5.5%的盐浓度范围内都能够生长,说明该菌的耐盐范围很广,适应性强。
　　菌株P14能够在以50mg/L的T和AD为唯一碳源的无机盐培养基中生长,不能够在以50mg/L的E1、E2、E3、EE2、ADD、P为唯一碳源的无机盐培养基中生长,说明P14能够利用类固醇激素T和AD为碳源进行生长。不添加其它碳源条件下检测对50mg/L的E1、E2、E3、EE2在7天内的降解情况。实验表明:菌株P14能够降解E3和T且降解能力较高在第七天的降解率分别为95.7%和69.97%;菌株P14能够降解E2但是降解能力不高约35%;菌株P14在7天内都不能降解E1、EE2。添加其它碳源的情况下测P14降解不同浓度的10mg/L、50mg/L、100mg/L的E2、T和EE2实验表明菌株P14能够内几乎完全降解10mg/L、50mg/L、100mg/L的E2和T,不能降解EE2。
　　利用GC-MS检测菌株P14在降解E2和T过程中的代谢产物,检测到E2的代谢产物E1和T的代谢产物雄甾-4烯-3.17二酮(Androst-4-ene-3,17-dione,AD)、雄甾-1、4二烯-3.17二酮(Androsta-1,4-diene-3,17-dione,ADD)和17羟基-17甲基-雄甾-1、4二烯-3酮(17-hydroxy-17-methyl-androsta-1,4-dien-3-one)。根据检测到的代谢产物,结合P14降解实验、全基因组信息和相关文献,推测P14降解E2可能途径有两种:第一种为E2降解为E1然后再转化为E3进一步降解,第二种为E2直接转化为E3进一步降解;推测P14降解T可能途径为T降解为AD,再进一步降解为ADD,或者T甲基化后,再脱氢转化为17-hydroxy-17-methyl-androsta-1,4-dien-3-one,再进一步降解,最后进入转化为二氧化碳和水。
　　根据红球菌P14全基因组测序精细图,对其进行基因功能注释发现:该菌具有类固醇激素降解相关的基因如ketosteroid-9α-hydroxylase(KSH)、3-ketosteroid-Δ1-hydrogenase(KSTD)、3α-hydroxy steroid dehydrogenase(3α-HSD)和3β-hydroxy steroid dehydrogenase(3β-HSD)等。运用全基因测序预测的基因全序列信息设计引物进行PCR扩增,构建了4个重组菌株分别为E.coliBL21(DE3)-pET-32a(+)-446Ksh、E.coliBL21(DE3)-pET-32a(+)-459Ksd、E.coliBL21(DE3)-pET-32a(+)-4229Ksh和E.coliBL21(DE3)-pET-32a(+)-2126Hsd,SDS-PAGE和Western Blotting验证构建重组菌异源表达成功。
　　重组菌E.coliBL21(DE3)-pET-32a(+)-4229Ksh和E.coliBL21(DE3)-pET-32a(+)-2126Hsd在1mMIPTG诱导培养10小时后降解50mg/L的E2的降解率达到35.34%和17.79%,重组菌E.coliBL21(DE3)-pET-32a(+)-446Ksh和E.coliBL21(DE3)-pET-32a(+)-2126Hsd在1mMIPTG诱导培养10小时后降解50mg/L的T的降解率达到14.89%和28.50%,因而认为2126(Hsd)基因与菌株P14降解T和E2降解相关,446(Ksh)基因与E2降解相关,4229(Ksh)基因与P14降解T降解相关。

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第1章 前言

1.1环境内分泌干扰物定义

1.2环境内分泌干扰物分类

1.4环境类固醇激素的来源

1.5环境类固醇激素的危害

1.6环境类固醇激素微生物降解

1.7本文的主要研究内容和意义

第2章 红球菌P14特性及降解类固醇激素研究

2.1 实验材料与方法

2.2 实验结果与讨论

2.3 小结

第3章 菌株P14对类固醇激素代谢初步研究

3.1 实验材料与方法

3.2 实验结果与讨论

3.3 小结

第4章 红球菌P14降解类固醇激素相关基因研究

4.1. 实验材料与方法

4.2. 实验结果与讨论

4.3. 小结

第5章 总结和展望

5.1. 总结

5.2. 展望

附录

参考文献

致谢