去甲基化机制在腺苷及同型半胱氨酸诱导肝癌HepG2细胞凋亡中的作用

摘要

研究目的:
　　探讨去甲基化机制在腺苷（ADO）与同型半胱氨酸（HCY）诱导肝癌 HepG2细胞的凋亡中的作用。
　　材料和方法：
　　HepG2细胞在含10％胎牛血清（FBS）的DMEM培养基中培养，胰酶消化、传代后按以下方法进行实验：①CCK-8法：细胞传代至96孔板中，待细胞贴壁后分别用不同浓度ADO(1.0、2.0、4.0 mmol·L-1)单独或者联合HCY(1.0、2.0、4.0 mmol·L-1)作用肝癌HepG2细胞不同时间（6h、12h、24 h）后细胞的生长抑制率；亦使用DNA甲基化酶抑制剂5-Aza-CdR（5.0、10.0、20.0μmol·L-1）分别处理HepG2细胞24、48、72h作为阳性对照。CCK-8法测定各实验组对HepG2细胞生长抑制的效应。②AnnexinV-FITC/PI双染法：细胞贴壁后加入正常培养基（阴性对照组和空白对照组）及ADO联合HCY（1.0、2.0、4.0 mmol·L-1）作用细胞24 h，流式细胞仪(FCM)检测细胞凋亡情况。③罗丹明123染色法：通过罗丹明123（Rho123）染色ADO联合HCY处理前后的HepG2细胞利用流式细胞术检测ADO联合HCY（1.0、2.0、4.0 mmol·L-1）处理24 h前后细胞线粒体膜电位（ΔΨm）变化。④荧光定量PCR（RT-qPCR）检测mRNA表达：提取ADO联合HCY（1.0 mmol·L-1）作用6 h后细胞总RNA，RT-qPCR法检测凋亡相关通路caspase-3、caspase-8、caspase-9、MDM-2、P53、Cytochrome C mRNA水平的表达；ADO联合HCY（1.0 mmol·L-1）6h、5-Aza-CdR（10.0μmol·L-1）72h后细胞总RNA，RT-qPCR法检测DNA甲基转移酶DNMT1、DNMT3a、DNMT3 mRNA水平的表达。⑤免疫印迹法检测蛋白表达：ADO联合HCY（1.0 mmol·L b-1）处理HepG2细胞，提取细胞总蛋白，Western blot检测caspase-3、caspase-8、caspase-9、MDM-2、P53、Cytochrome C蛋白的表达。
　　结果
　　1、CCK-8结果显示，单独使用 HCY对肝癌 HepG2细胞增殖无明显抑制作用，而ADO单独或联合 HCY、5-Aza-CdR，随浓度增加，处理组吸光值（OD值）减少，与对照组相比，有显著性差异（P<0.05）。
　　2、Annexin V-FITC/PI双荧光染色流式细胞术检测显示，随着ADO联合HCY处理剂量的增加，细胞凋亡率逐渐升高，呈现出一定的剂量依赖性关系，表明 ADO联合 HCY是通过诱导细胞凋亡抑制细胞增殖。
　　3、流式细胞术检测线粒体膜电位（ΔΨm）结果表明，随着ADO联合HCY处理剂量的增加，ΔΨm显著下降（P<0.01）。
　　4、RT-qPCR检测结果显示，ADO联合HCY（1.0 mmol·L-1）处理HepG2细胞6h后，P53、Cytochrome C、caspase-9、caspase-8和Caspase-3表达量均上升，而MDM-2表达量下降，与对照组比较均有统计学意义（P<0.05）。5-Aza-CdR（10.0μmol·L-1）与ADO联合HCY（1.0 mmol·L-1）分别处理HepG2细胞72h与6h，DNA甲基转移酶DNMT1、DNMT3a、DNMT3b mRNA表达下降，与对照组比较均有统计学意义（P<0.05）。
　　5、Western blot检测结果显示，ADO联合HCY（1.0 mmol·L-1）处理HepG2细胞6h后， P53、Cytochrome C、caspase-9、caspase-8和Caspase-3表达均上升，而MDM-2表达下降，与对照组比较均有统计学意义（P<0.05）。
　　结论：
　　1、ADO联合HCY及甲基化抑制剂5-Aza-CdR均能抑制人肝癌HepG2细胞增殖，同时联合应用ADO及HCY导致了细胞凋亡。
　　2、在此过程中，HCY与ADO联合作用及5-Aza-CdR引起了DNA甲基转移酶DNMT1、DNMT3a、DNMT3b的改变，诱导细胞甲基化水平的降低，激活抑癌基因P53，同时活化了线粒体相关因子 Cyt-C、caspase-9，并伴线粒体膜电位下降，表明线粒体通路参与了致肝癌HepG2细胞凋亡的过程。活化死亡受体通路相关因子caspase-8，我们猜测死亡受体通路也可能参与此过程。

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第一章 前 言

1.1 研究背景

1.2 本课题的基金来源

1.3 本研究课题的目的和意义

1.4 研究内容

第二章 材料及方法

2.1 实验材料

2.2 技术路线

2.3 实验方法

2.4 统计学分析

第三章 结 果

3.1 CCK-8法检测细胞生长抑制

3.2 AnnexinV-FITC /PI 双染法检测细胞凋亡

3.3 RT-qPCR检测细胞相关基因mRNA水平的表达

3.4 Western blot检测细胞凋亡相关蛋白的表达

3.5 Rho123探针检测MMP的变化

第四章 讨 论

参考文献

附录 试剂配制

致谢

个 人 简 介