溶血磷脂酸(LPA)诱导人口腔鳞癌细胞中整合素β6表达的分子机制

摘要

目的：整合素αvβ6是由αv和β6亚单位组成的上皮特异性表达异二聚体，在口腔鳞癌中异常高表达，促进肿瘤细胞的迁移和侵袭。由于β6只能与αv亚基组成二聚体，因此β6是调控αvβ6表达的关键亚基。LPA是一种存在于唾液和血液并具有多种生物活性的甘油磷脂，能促进细胞的增殖、迁移和侵袭。我们课题组在前期研究中发现LPA能上调正常上皮细胞整合素β6表达，但尚不清楚口腔鳞癌中LPA是否上调αvβ6的表达促进肿瘤的发生、发展。因此，本研究先研究LPA是否能诱导口腔鳞癌细胞系SAS细胞整合素β6表达，并探讨LPA诱导口腔鳞癌细胞系SAS细胞整和素β6表达的分子机制，为进一步探究整合素avβ6在口腔鳞癌中过度表达的分子机制奠定基础。
　　方法：用定量PCR和Western blot检测LPA诱导SAS细胞后β6的mRNA和蛋白表达量。用特异性抑制剂和siRNA寻找参与LPA诱导SAS细胞β6表达上调的受体及其偶联的Gα亚基。用双荧光报告系统检测启动子活性，探究β6启动子上的LPA应答元件。用Chip方法和转录因子特异性siRNA确定参与LPA诱导β6表达的转录因子。最后用特异性抑制剂探究GPCR转激活EGFR是否参与β6的表达，在体外研究LPA上调口腔鳞癌β6表达的机制。
　　结果：
　　1. LPA能上调SAS细胞β6的mRNA和蛋白表达。
　　2. LPA1/3抑制剂KI16425抑制LPA上调SAS细胞β6 mRNA和蛋白的表达。转染LPA1 siRNA阻断LPA上调SAS细胞β6 mRNA的表达。
　　3. Gi/O抑制剂PTX抑制LPA上调SAS细胞β6 mRNA和蛋白的表达。
　　4. LPA不能增加SAS细胞β6 mRNA的稳定性。LPA上调SAS细胞β6启动子活性。
　　5.β6基因转录起始位点-150~+22 bp处存在SMAD2/3和ETS家族转录因子潜在结合位点参与LPA增加β6的启动子活性。
　　6. LPA促使转录因子SMAD3和ETS-1结合到β6启动子。转染SMAD3和ETS-1 siRNA阻断LPA诱导SAS细胞β6 mRNA的表达。
　　7. LPA通过LPA1和Gi/O促进SAS细胞 SMAD3和ETS-1磷酸化，并结合到β6启动子。
　　8. LPA增加SAS细胞 EGFR磷酸化水平。EGFR特异性抑制剂AG1478抑制LPA诱导SAS细胞β6的mRNA和蛋白表达。
　　结论：
　　1. LPA通过LPA1及其偶联的Gi/O上调口腔鳞癌细胞系SAS细胞β6的表达。
　　2. LPA通过活化转录因子SMAD3和ETS-1促进口腔鳞癌细胞系SAS细胞β6的转录。
　　3. LPA通过激活EGFR促进口腔鳞癌细胞系SAS细胞β6的表达。

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第一章 前言

基金项目支持

第二章 实验材料和仪器

2.1 细胞来源

2.2 主要试剂

2.3 主要仪器

第三章 试验方法

3.1 细胞培养

3.2 mRNA稳定性实验

3.3总RNA提取和定量PCR

3.4 Western blotting 检测蛋白表达情况

3.5 重叠延伸进行定点突变载体构建

3.6瞬时转染

3.7双荧光素酶报告基因活性检测

3.8染色质免疫共沉淀（ChIP）

3.9 MTT检测细胞毒性

3.10 统计学分析

第四章 结果

4.1 LPA上调口腔鳞癌细胞系SAS细胞 β6 mRNA和蛋白的表达

4.2 LPA1参与LPA上调口腔鳞癌细胞系SAS 细胞β6的表达

4.3 Gi亚单位参与LPA上调口腔鳞癌细胞系SAS细胞β6的表达

4.4 LPA通过转录激活上调口腔鳞癌细胞系SAS细胞β6表达

4.5 SMAD和ETS转录因子结合元件参与LPA诱导的β6转录激活

4.6 SMAD3参与LPA上调口腔鳞癌细胞系SAS细胞β6表达

4.7 ETS-1参与LPA上调口腔鳞癌细胞系SAS细胞β6表达

4.8 p-SMAD3和p-ETS-1参与LPA上调口腔鳞癌细胞系SAS细胞β6表达

4.9 EGFR参与LPA上调口腔鳞癌细胞系SAS细胞β6的表达

4.10 LPA诱导口腔鳞癌细胞系SAS细胞β6表达上调的示意图

第五章 讨论

5.1 LPA上调口腔鳞癌细胞系SAS 细胞β6表达

5.2 LPA通过LPA1，Gi/o，EGFR上调口腔鳞癌细胞系SAS 细胞β6表达

5.3 LPA通过转录因子SMAD3和ETS-1转录激活口腔鳞癌细胞系SAS细胞β6的表达

第六章 结论与展望

5.1 结论

5.2 展望

参考文献

附录 I 试剂配制

附录 II缩略词表

个人简介

硕士期间发表论文情况

致谢