宫颈癌细胞中免疫球蛋白G通过结合TLR4促进LPS诱导产生促炎性因子

摘要

背景和目的：
　　经典的理论认为仅仅B淋巴细胞和浆细胞能产生免疫球蛋白，但这种理论目前正在受到挑战。新近的研究表明许多癌细胞表达免疫球蛋白G（IgG）。然而，癌源性IgG的功能和暗含的机制目前还不清楚。Toll样受体（TLRs）在天然免疫中起到关键作用，它可以识别来源于微生物的具有保守结构的分子。在TLRs中，TLR4是一个关键的成员，它通过激活信号通路启动天然免疫反应。最近的研究显示，TLR4不仅在免疫细胞中表达，在癌细胞中也表达如宫颈癌，肺癌，乳腺癌等等。TLR4在多种癌细胞中的表达暗示了TLR4信号通路可能在肿瘤的发生发展以及免疫过程中起到了关键作用。因此，本研究对癌源性IgG是否与TLR4相互作用以及其作用机制进行了深入地研究。
　　材料与方法：
　　1.材料BALB/c裸鼠（4-6周，雌性）购买于维通利华实验动物技术有限公司（北京，中国）。人宫颈癌组织和他们的正常组织来自汕头大学附属肿瘤医院，该研究项目获得汕头大学医学院伦理委员会的批准。人宫颈癌细胞系HeLa和SiHa均购自ATCC。
　　2.免疫印迹蛋白样品加入相应体积loading buffer后,100℃煮5分钟,经SDS PAGE胶电泳分离后，转移到硝酸纤维素膜上。膜用5％BSA封闭后2小时后，一抗在4℃旋转过夜，第二天早上孵育相应的二抗后，用Odyssey远红外扫描仪扫描。
　　3.酶联免疫分析:根据ELISA kit的说明书检测细胞上清液中的TNF-α、IL-6、IL-1β的蛋白水平。
　　结果：
　　1.在LPS刺激后的宫颈癌细胞中IgG表达动力学；
　　2.在宫颈癌细胞中沉默IgG抑制LPS诱导产生促炎性因子；
　　3.在宫颈癌细胞中IgG表达下调抑制LPS激活的TLR4信号通路；
　　4.在宫颈癌细胞中IgG表达下调破坏LPS诱导的NF-κB核转移和其应答元件的活性；
　　5.在宫颈癌细胞中LPS诱导IgG与TLR4相互作用；
　　6. IgG表达下调抑制TLR4的表达；
　　7.在IgG表达下调的宫颈癌细胞中TLR4调节LPS诱导产生促炎性因子；
　　8.体内实验验证IgG表达下调降低LPS诱导产生促炎性因子；
　　9.人宫颈癌组织中IgG和TLR4的表达与促炎性因子密切相关。
　　结论：
　　在本研究中，我们证明了在宫颈癌细胞中加入LPS后IgG的表达有了显著地变化，在宫颈癌细胞中LPS诱导IgG与TLR4相互作用，这表明IgG有可能是受到TLR4信号通路的调控。IgG表达水平的下调使LPS诱导产生的炎症因子表达减弱。IgG的下调同时抑制了NF-κB和MAPK的磷酸化水平，从而破坏了NF-κB的核转运以及应答元件的活性。因此，实验结果表明在LPS刺激后TLR4能够招募胞浆中的IgG，而IgG沉默是通过下调TLR4的表达抑制LPS诱导的炎症因子的产生。
　　我们的发现表明IgG是通过结合和加强TLR4的表达来正性调控LPS诱导的促炎性因子的产生。IgG与TLR4的互动很可能在炎症诱发癌症的发展过程中会起到促进作用。

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附录 缩略语表

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第一章 引言

第二章 材料和方法

2.1材料

2.1.1标本来源

2.1.2细胞系、人体组织标本和转染

2.1.3主要仪器设备

2.1.4主要试剂

2.1.5主要溶液配制

2.1.6 软件和数据库

2.1.7 所用耗材

2.2实验方法

2.2.1免疫沉淀与免疫共沉淀及免疫印迹

2.2.2 BCA法测定蛋白浓度

2.2.3免疫组化

2.2.4 免疫荧光

2.2.5 Real-time RT-PCR

2.2.6 感受态细胞制备

2.2.7感受态细菌的大量制备

2.2.8感受态细菌的转化

2.2.9细菌质粒DNA的制备

2.2.10菌种复苏与保存

2.2.11 细胞操作前的准备

2.2.12 细胞复苏

2.2.13 细胞换液

2.2.14 细胞传代

2.2.15 细胞冻存

2.2.16 细胞计数与铺板

2.2.17 siRNA干扰

2.2.18 流式细胞仪检测TLR4表达水平

2.2.19裸鼠内毒血症形成实验

2.2.20 酶联免疫分析检测TNF-α、IL-6、IL-1β的蛋白水平

2.2.21 HE染色

2.3.22 琼脂糖凝胶电泳

2.2.23胞浆-胞核蛋白提取（Thermo）

2.2.24 DNA转染

2.2.25 统计分析

第三章 结果

3.1在LPS刺激后的宫颈癌细胞中IgG表达动力学

3.2在宫颈癌细胞中沉默IgG抑制LPS诱导产生促炎性因子

3.2.1 IGHG1 siRNA在蛋白和mRNA水平显著下调HeLa细胞和SiHa细胞中IgG的表达

3.2.2 IgG表达下调抑制HeLa和SiHa细胞中LPS诱导产生促炎性因子

3.3在宫颈癌细胞中IgG表达下调抑制LPS激活的TLR4信号通路

3.4 在宫颈癌细胞中IgG表达下调破坏LPS诱导的NF-κB核转移和其应答元件的活性。

3.5在宫颈癌细胞中LPS诱导IgG与TLR4相互作用

3.6 IgG表达下调抑制TLR4的表达

3.7在IgG表达下调的宫颈癌细胞中TLR4调控LPS诱导产生促炎性因子

3.8体内实验证实IgG表达下调降低LPS诱导产生促炎性因子

3.9人宫颈癌组织中IgG和TLR4的表达与促炎性因子密切相关

第四章 讨论

参考文献

致谢

个人简历