肿瘤坏死因子α诱导人口腔鳞癌细胞中C-C趋化因子2表达的分子机制

摘要

研究目的：
　　CCL2是重要的促炎细胞因子，对单核/巨噬细胞具有特异性趋化激活作用，参与口腔癌的发生及发展。TNF-α是一种主要由巨噬细胞分泌并参与炎症反应的细胞因子，能诱导包括CCL2在内的各种炎症相关因子的表达。但TNF-α诱导口腔鳞癌细胞CCL2基因表达的分子机制未知。由于基因的转录调控与基因启动子区转录因子的结合状态及组蛋白修饰密切相关。本研究拟通过研究人口腔鳞癌细胞中CCL2基因启动子区转录因子的结合水平及组蛋白乙酰化、甲基化修饰水平，来探讨TNFα诱导CCL2高表达的转录调控机制，为进一步探究CCL2在口腔鳞癌中表达的分子机制奠定基础。
　　研究方法：
　　培养人口腔鳞癌细胞，用TNFα（10μg/L）刺激，利用ELISA法检测细胞培养上清液中CCL2的蛋白表达；提取细胞裂解液中总RNA并逆转录合成cDNA，利用实时定量PCR检测CCL2 mRNA表达水平；采用染色质免疫共沉淀（Chip）技术检测在TNFα诱导下CCL2启动子区组蛋白H3R17甲基化水平、H3和H4的乙酰化水平、组蛋白甲基转移酶CARM1、组蛋白乙酰基转移酶p300、CBP以及转录因子NF-κB、AP-1与CCL2启动子结合情况；Western Blot检测NF-κB p65胞浆胞核分布情况以及组蛋白H3、H4乙酰化水平。用小分子 RNA阻断CARM1，并检测其对 CCL2启动子区 NF-kB、p-NF-kB、CARM1、H3R17me2a、CBP以及组蛋白H3、H4乙酰化水平的影响。
　　研究结果：
　　1、 TNFα可诱导人口腔鳞癌细胞中CCL2 mRNA和蛋白的表达。
　　2、组蛋白甲基转移酶CARM1介导的CCL2启动子区H3R17甲基化水平升高参与TNFα诱导口腔鳞癌细胞CCL2表达。
　　3、通过染色质免疫共沉淀技术发现，TNFα能诱导人口腔鳞癌细胞中转录因子NF-kB（p65）、AP-1（c-jun）与 CCL2启动子区结合增加。siRNA沉默 CARM1后，TNFα诱导的NF-kB（p65）、p-NF-kB与CCL2启动子结合显著下降。
　　4、染色质免疫沉淀检测到 TNFα诱导的 CCL2启动子区组蛋白乙酰化水平以及组蛋白乙酰基转移酶p300/CBP结合量升高。转染siRNA沉默CARM1后，组蛋白乙酰化蛋白表达水平显著降低，同时CCL2启动子区组蛋白乙酰化水平降低，CBP与CCL2启动子结合显著下降。
　　研究结论：
　　TNFα可通过介导组蛋白甲基转移酶CARM1与CCL2启动子区结合增加从而诱导人口腔鳞癌细胞中CCL2 mRNA和蛋白表达，其中CARM1通过介导CCL2启动子区组蛋白H3R17甲基化水平及组蛋白H3和H4乙酰化水平增高，进而诱导转录因子NF-kB（p65）和AP-1（c-jun）与CCL2启动子结合增多，从而促进CCL2转录表达。

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第一章 前言

第二章 实验材料和仪器

2.1细胞来源

2.2 主要试剂

2.3 主要仪器

第三章 实验方法

3.1 细胞培养

3.2酶联免疫吸附测定实验

3.3总RNA提取和PCR

3.4 Western blotting 检测蛋白变化情况

3.5转染

3.6染色质免疫共沉淀（Chip）

第四章 实验结果

4.1 TNFα 对人口腔鳞癌细胞 SAS 和 TCA8113 CCL2 蛋白释放及mRNA表达水平的影响

4.2 转录因子 NF-kB和 AP-1 参与 TNFα 诱导的 SAS 细胞 CCL2表达

4.3 TNFα对人口腔鳞癌细胞SAS组蛋白乙酰化水平的影响

4.4 TNFα诱导对人口腔鳞癌细胞SAS CCL2启动子区组蛋白乙酰基转移酶影响

4.5 TNFα对人口腔鳞癌细胞SAS组蛋白甲基化水平的影响

4.6 TNFα诱导对人口腔鳞癌细胞SAS CCL2启动子区组蛋白甲基转移酶影响

4.7敲减CARM1对TNFα诱导的人口腔鳞癌细胞SAS组蛋白乙酰化水平的影响

4.8 敲减CARM1对TNFα诱导人口腔鳞癌细胞SAS CCL2启动子区组蛋白乙酰基转移酶的影响

4.9 敲减CARM1对TNFα诱导人口腔鳞癌细胞SAS CCL2启动子区转录因子的影响

4.10 敲减CARM1对TNFα诱导人口腔鳞癌细胞SAS CCL2基因表达的影响

第五章 讨论

第六章 结论与展望

参考文献

附录1 试剂配制

附录2 CCL2概览

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