镉耐受性BEAS-2B细胞中锌转运蛋白的表达变化以及非同义性ZIP8(SLC39A8)的功能研究

摘要

背景：ZIP8(SLC39A8)是一种转运二价金属离子的膜蛋白，属于锌离子转运蛋白家族中的一员，把金属离子从细胞外周或者细胞器运输到细胞质内。ZIP8能转运人体所必需的多种金属元素如锌、铁、锰等，它所介导的锌的转运能够激活免疫 T细胞、调节先天性免疫系统、以及促进骨性关节炎的病变。另外，ZIP8对重金属元素镉也有很强的结合能力，它在睾丸血管内皮细胞中的特异性表达导致小鼠对镉的敏感性提高。在带有三个SLC39A8拷贝的转基因小鼠中，也发现镉诱导的睾丸坏死和肾衰竭比在正常小鼠身上更为严重。在多种镉耐受细胞，包括本实验室已经证明的大鼠肺上皮细胞（rat lung epithelial cell，rLEC）中，ZIP8的表达量相比其他金属转运蛋白都显著下降，表明ZIP8可能是镉进入哺乳动物细胞的主要途径之一。
　　近年来，多个基因组关联分析（GWAS, genome-wide association study）表明位于SLC39A8编码区上的一个单核苷酸多态性突变（single nucleotide polymorphism,SNP）与多种复杂疾病如高血压，肥胖以及精神分裂症有关联。该SNP(rs13107325)，是非同义性的，把ZIP8蛋白391位点上原来的丙氨酸(alanine,A)突变成苏氨酸(threonine,T)，目前还不清楚该突变是否会影响ZIP8的金属转运能力。
　　目的：
　　1.探究在镉耐受性人肺支气管上皮细胞BEAS-2B中锌离子转运蛋白家族的表达变化。
　　2.制作出效价高、特异性强的抗人ZIP8的抗体用于ZIP8蛋白的检测。
　　3.探究ZIP8蛋白A391位点的单核苷酸多态性突变(rs13107325)是否以及如何影响其功能。
　　方法：
　　1.利用半定量PCR筛选锌离子转入蛋白家族ZIP/SLC39A和转出蛋白家族ZnT/SLC30A在镉耐受性和镉敏感性BEAS-2B细胞中的mRNA表达水平。
　　2.在大肠杆菌中诱导并纯化包含ZIP8肽段的GST融合蛋白。
　　3.以背部皮下和耳缘静脉注射的方式，将包含ZIP8肽段的GST融合蛋白作为抗原免疫新西兰白兔。
　　4.利用ELISA、Western blot和免疫荧光染色检测ZIP8抗血清的效价和特异性。
　　5.通过Western blot和免疫荧光染色检测ZIP8在镉耐受性和镉敏感性BEAS-2B细胞中的表达水平。
　　6.采用点突变技术构建表达ZIP8 A391T和ZIP8 A391E突变体的载体，利用Genectin在HeLa细胞中筛选表达ZIP8 wild type、ZIP8 A391T以及ZIP8 A391E的稳定表达细胞系。
　　7.通过检测细胞存活率（NBB染色）和细胞内锌离子的水平（原子吸收光谱）研究ZIP8 A391上的单核苷酸多态性突变(rs13107325)对其转运金属离子能力的影响。
　　结果：
　　1.在所有ZIP和ZnT家族中，ZIP8的mRNA水平在镉耐受性BEAS-2B细胞中，相对于镉敏感性细胞，下降地最为显著；ZnT1的mRNA水平则增加的最为显著。
　　2.在注射了ZIP8抗原的新西兰白兔中，我们分离并纯化出的抗ZIP8血清能够用于Western blot和免疫荧光实验。
　　3.使用本实验室制作的抗ZIP8血清来检测其蛋白水平变化，发现ZIP8在镉耐受性BEAS-2B细胞中的表达显著下降。
　　4.通过NBB染色检测细胞生存率，我们发现ZIP8 A391T细胞系，细胞生存率显著高于ZIP8 WT稳定转染细胞系。通过原子吸收光谱检测细胞内锌离子的水平，发现ZIP8 A391T细胞，相对ZIP8 WT，细胞内锌离子的水平有所降低。
　　结论：
　　1.IP8的表达水平下降和ZnT1表达水平的升高很可能是 BEAS-2B细胞产生镉耐受性的原因。
　　2.我们制作的抗ZIP8血清效价高、特异性强，为以后进一步研究ZIP8的生物功能奠定了基础。
　　3.ZIP8 A391位点的单核苷酸多态性突变(rs13107325)极有可能降低了其对金属离子的转运能力。

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第一章 前言

1.1 重金属镉转运的机制

1.2 锌离子转运蛋白ZIP8（SLC39A8）的研究进展

1.3本研究的内容和意义

第二章 实验材料

2.1 细胞、菌株和质粒

2.2 主要试剂

2.3 主要仪器

2.4 试剂配制

第三章 实验方法

3.1 细胞培养及处理

3.2 NBB法测定细胞的存活率

3.3 细胞总RNA提取(TRIzol法)

3.4 反转录反应

3.5 Western blot检测蛋白变化情况

3.6兔多抗的制备

3.7 免疫荧光实验

3.8 ELISA

3.9细胞内锌离子含量的测定

3.10统计学分析

第四章 实验结果

4.1 兔抗人ZIP8多克隆抗体的制备

4.2 探究ZIP与ZnT家族成员在镉耐受性BEAS-2B细胞中的表达变化

4.3 ZIP8 A391位点突变对其功能的影响

第五章 讨论

5.1 ZIP8抗体的制备

5.2 ZIP8在锌信号通路中的作用

5.3 ZIP8、ZIP14、ZnT1与DMT1在镉离子转运过程中的作用

5.4 锌转运蛋白的基因突变和单核苷酸多态性与人类疾病的联系

参考文献

致谢

个人简历

研究生期间发表论文情况