低/高代数毛乳头细胞差异RNA分析及miR-195-5p作用机制研究

摘要

研究背景：
　　毛乳头细胞在毛囊发生和周期性再生中具有关键的作用，但是在培养过程中，逐渐失去毛囊诱导力。因此，揭示低/高代数毛乳头细胞毛囊诱导功能差异的分子机制，是研究毛乳头细胞毛囊诱导功能关键点。目前研究证实microRNA（miRNA）在毛囊再生中发挥重要作用；Long non coding RNA（LncRNA）作为一种新的RNA在多个层次参与基因表达调控。
　　目的：
　　1.比较低代和高代毛乳头细胞的毛囊诱导能力。
　　2.筛查低代数和高代数毛乳头细胞miRNA，LncRNA的差异表达。
　　3.分析差异表达的miRNA，LncRNA在毛乳头细胞中可能发挥的作用。
　　4.分析miRNA，LncRNA与WNT通路的关系，筛选对WNT经典通路有影响的miRNA，LncRNA。
　　5.研究hsa-miR-195-5p（miR-195-5p）与WNT信号通路的关系，揭示其影响毛乳头细胞毛囊诱导功能的作用机制。
　　方法：
　　1.从人头皮分离毛乳头细胞进行原代培养，连续传代至第10代，对比毛乳头细胞的形态和聚集状态。
　　2.以第4代和第10代毛乳头细胞分别作为低代数和高代数毛乳头细胞，注射到裸鼠背部，定期观察及HE染色观察毛囊再生的情况。
　　3. microarray芯片分别检测低代数和高代数毛乳头细胞的miRNA和LncRNA表达。
　　4. Q-PCR对差异miRNA和LncRNA进行验证，生物信息学对差异miRNA和LncRNA进行分析。
　　5.预测差异表达miRNA的靶基因，建立差异表达miRNA和WNT通路的网络图。
　　6.通过以下方法建立LncRNA与WNT通路的联系：
　　① LncRNA邻近的编码RNA属于WNT通路；
　　② LincRNA300kb之内的编码RNA属于WNT通路；
　　③ Enhancer LncRNA300kb之内的编码RNA属于WNT通路；
　　④建立CNC网络结构。
　　7.在第4代毛乳头细胞中转染miR-195-5p mimics，研究miR-195-5p在毛乳头细胞中的作用机制：
　　① Western Blot检测细胞中β-catenin的表达；
　　② Target Scan，miranda和mirbase预测miR-195-5p的靶基因；
　　③ Western Blot检测靶基因的蛋白表达变化；同时使用Q-PCR方法检测靶基因mRNA表达变化；
　　④ Western Blot检测WNT通路下游，且与毛囊诱导能力相关的标记基因的表达。
　　结果：
　　1.毛乳头细胞随代数的增加逐渐失去多层聚集能力；低代数毛乳头细胞能够诱导裸鼠背部长出毛发，而高代数细胞不能。
　　2．miRNA microarray结果检测到1924个miRNA,低代数的毛乳头细胞相对于高代数毛乳头细胞显著上调有27个miRNA，下调有106个。（阈值:大于1.5倍，P＜0.05）；LncRNA microarray检测到1,4211个 LncRNA和2,0436个 mRNA，低代数的毛乳头细胞相对于高代数毛乳头细胞显著上调有1773个LncRNA和1703个mRNA，下调有1683个LncRNA和2010个mRNA（阈值:大于2.0倍，P＜0.05）。Q-PCR证实miRNA、LncRNA变化趋势与基因芯片相同。
　　3.建立的miRNA和WNT通路的网络图中发现：①低代毛乳头细胞中高表达抑制WNT非经典通路的miRNA，高代毛乳头细胞中高表达抑制WNT/β-catenin经典通路的miRNA；②miR-30a-5p，miR335-5p，miR-516a-5p，miR-195-5p有可能参与WNT/β-catenin的激活或抑制。
　　4.分析差异的LncRNA和WNT通路的联系，发现：HOTAIR，H19，RP11-766N7.3有可能参与WNT经典通路的调控。
　　5.β-catenin在细胞中的表达量与miR-195-5p mimics转染浓度有关，LRP6在蛋白和mRNA水平表达同时下调；同时位于WNT通路下游的基因的也下调。
　　结论：
　　1.只有表现多层聚集能力的低代数毛乳头细胞能够直接诱导毛囊再生。
　　2.低代毛乳头细胞高表达抑制WNT非经典通路的miRNA；随毛乳头细胞代数增加，细胞中表达抑制WNT/β-catenin经典通路的miRNA上调。
　　3. miR-30a-5p，miR335-5p，miR-516a-5p，miR-195-5p可能参与WNT/β-catenin的激活或抑制。
　　4. HOTAIR，H19，RP11-766N7.3可能参与WNT经典通路的调控。
　　5. miR-195-5p抑制毛乳头细胞WNT/β-catenin经典通路的活化从而调控毛乳头细胞毛囊诱导功能。

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缩略语释义表(List of abbreviations)

目录

前言

毛乳头细胞的诱导功能与WNT信号讨论

miRNA在毛囊再生中作用的研究

长链非编码RNA在WNT通路中的作用

总结

技术路线

第一章低代数和高代数毛乳头细胞诱导特性的验证和差异RNA的筛查

前言

实验材料

实验方法

实验结果

讨论

小结

第二章低/高代数毛乳头细胞差异表达的RNA的生物信息分析

第一节 低/高代数毛乳头细胞差异表达的miRNA的生物信息学分析

第二节低/高代数毛乳头细胞差异表达的LncRNA的生物信息学分析

第三章miR-195-5p毛囊诱导功能作用机制的研究

前言

实验材料

实验方法

结果

讨论

小结

参考文献

附录

综述: miRNA在毛囊发生中的作用和机制

发表论文情况

个人简历

致谢