二甲双胍对食管癌细胞和正常食管上皮细胞凋亡作用的比较

摘要

背景及目的：
　　食管癌是消化系统常见的恶性肿瘤之一，在全球癌症导致死亡原因中排名第六位，目前联合手术与放化疗的综合治疗是治疗食管癌的主要方法。传统放疗与抗肿瘤药物的副作用严重阻碍其应用与发展，因此寻找一种在抗肿瘤的同时又尽量减少对正常细胞损伤的药物对食管癌的治疗有极其重要的意义。二甲双胍是传统的口服降糖药，是治疗2型糖尿病患者的一线治疗药物。近期研究表明，二甲双胍不仅有降血糖的作用，还有抗肿瘤的生物效应。我们前期的研究也发现二甲双胍可以诱导食管癌细胞株增殖抑制、细胞周期停滞、抑制食管癌细胞侵袭转移和增强其对化疗药物的敏感性等作用。许多研究主要集中于探讨二甲双胍对肿瘤细胞的作用机制，然而对正常细胞的作用研究却鲜有报道。信号传导及转录激活因子3（signal transducer and activator of transcription3，Stat3）是近年公认的一种癌基因，其信号传导通路在肿瘤细胞中异常激活并在肿瘤的发生发展中发挥重要的作用，而它在正常细胞处于短暂激活或者不激活状态。本实验在之前的研究基础上，以 Stat3为靶点进一步探讨二甲双胍对食管癌细胞及正常食管上皮细胞作用的差异，为二甲双胍在预防及治疗食管癌的临床应用提供新的靶向与理论基础。
　　材料和方法：
　　1.用含10％胎牛血清、100U/ml链霉素和100U/ml青霉素的DMEM培养基培养人食管鳞癌细胞株EC109和人正常食管上皮细胞株HEEC。
　　2. CCK-8方法分别检测经二甲双胍对人食管癌细胞株 EC109和人正常食管上皮细胞株HEEC的增殖抑制情况。
　　3. Annexin V-FITC/PI双染流式法分别检测二甲双胍对人食管癌细胞株EC109和人正常食管上皮细胞株HEEC的凋亡情况。
　　4.实时荧光定量 RT-PCR与蛋白免疫印迹法(Western Blot)分别检测人食管癌细胞株EC109和人正常食管上皮细胞株HEEC细胞内Stat3的基础表达情况。
　　5.蛋白免疫印迹法(Western Blot)分别检测经不同浓度的二甲双胍处理以及添加 IL-6后Stat3的活化程度和抗凋亡蛋白Bcl-2的表达情况。
　　6. DCFH-DA荧光探针检测不同浓度的二甲双胍对食管癌细胞株EC109和正常食管上皮细胞株HEEC细胞内活性氧的水平的影响。
　　7.实验数据分析和处理：采用单因素方差分析(One-way ANOVA)进行组内比较，两细胞株之间的比较采用两个独立样本的t检验进行比较；应用SPSS19.0统计软件进行数据分析，GraphPad Prism5.0软件进行图表制作。
　　结果：
　　1.二甲双胍对食管癌EC109细胞和正常食管上皮HEEC细胞都有抑制增殖的作用，对食管癌EC109细胞的抑制作用较明显。
　　2.二甲双胍对食管癌EC109细胞有诱导凋亡的作用并呈浓度依赖，但相同浓度的二甲双胍对正常食管上皮HEEC细胞无此作用。
　　3.无论在mRNA水平或者在蛋白水平，食管癌EC109细胞中Stat3的表达高于正常食管上皮HEEC细胞中的表达。
　　4.二甲双胍抑制Stat3的磷酸化，下调其下游靶基因Bcl-2的表达，诱导食管癌EC109细胞凋亡，并且当添加了IL-6后，此作用部分被逆转；而在正常食管上皮HEEC细胞中此作用不明显。
　　5.二甲双胍可以提高食管癌EC109和正常食管上皮HEEC细胞内活性氧水平，但与凋亡的发生无明显关系。
　　结论：
　　1.二甲双胍对食管癌EC109细胞及正常食管上皮HEEC细胞的作用存在差异。
　　2.二甲双胍可能通过抑制Stat3的磷酸化，下调Bcl-2的表达，诱导食管癌EC109细胞凋亡，而对正常食管上皮HEEC细胞无此作用。

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第一章 前言

第二章 材料和方法

2.1 实验仪器和设备

2.2 主要试剂

2.3 细胞株

2.4 实验相关试剂及配制

2.5 实验器皿的准备

2.6 实验方法

第三章 实验结果

3.1 二甲双胍对EC109和HEEC细胞增殖的影响

3.2 二甲双胍对EC109和HEEC细胞凋亡的影响

3.3 Stat3在EC109及HEEC细胞中的表达的差异

3.4 二甲双胍对EC109及HEEC细胞Stat3磷酸化水平及Bcl-2的影响

3.5 二甲双胍下调Stat3磷酸化水平及Bcl-2的表达,诱导EC109细胞发生凋亡

3.6 二甲双胍诱导细胞凋亡与细胞内活性氧水平的关系

第四章 讨论

第五章 结论

展望和不足

参考文献

在校期间发表论文情况

致谢

个人简历