miRNA-451a在不同心肌肥厚模型的表达及其对心肌肥厚的影响

摘要

背景：当机体血流动力学紊乱、急性心肌损伤或肌节蛋白编码基因发生突变，心脏为了适应应激反应而发生心肌肥厚。心肌肥厚的主要特征为细胞体积增大、胚胎心脏基因的重新激活，例如心房钠尿肽（Nppa）、B型脑钠肽（Nppb）、β肌球蛋白重链（Myh7）。尽管心肌肥厚早期多为一种代偿性反应，但心脏肥厚进入失代偿后会引起心力衰竭、心律失常以及心源性猝死，预后不良。
　　心肌肥厚受环境刺激及机体神经-内分泌调节的共同调控。临床上常把心肌肥厚的病因归结为前负荷增大和后负荷增大。前负荷指心肌收缩前所遇到的阻力或负荷，而前负荷增大则常见于：1）心脏瓣膜病，如二尖瓣、三尖瓣、主动脉瓣关闭不全；2）先天性心脏病，如房间隔、室间隔缺损，动脉导管未闭；3）全身性血容量改变，如急性大量输液、甲亢、贫血等。后负荷指心肌收缩之后所遇到的阻力或负荷，后负荷增大常见于高血压、主动脉瓣狭窄、主动脉缩窄、慢性阻塞性肺病等导致体肺循环阻力增大的疾病。
　　微小RNA（miRNA）是一类长度约为18-25核苷酸的小分子内源性单链的非编码RNA，第一个被发现的miRNA是由Lee等于1993年首先在线虫体内发现的，该miRNA被命名为lineage-deficient-4(lin-4)。现今发现多种miRNAs的存在，miRNA能与靶mRNA分子的3’端非编码区的互补序列相结合，从而降解靶mRNA、抑制靶mRNA的转录及蛋白质翻译等。近年来随着miRNA与心血管疾病方面的研究日益增多，人们发现miRNA参与许多心血管疾病的发生，如心律失常、心肌肥厚、动脉粥样硬化、血管生成等。同一个miRNA可作用于多个靶基因,同一个靶基因也可被多个miRNA调控，故miRNA在生物蛋白质合成等发挥着独特且重要的作用。
　　Van Rooij等人首次使用芯片技术研究胸主动脉缩窄及过表达钙调素的转基因小鼠两种病理性心肌肥厚动物模型的miRNA表达谱，结果显示两种模型的miRNA谱大致相同。以往文献报导心肌肥厚过程中，miR-1，miR-133， miR-101，miR-10a，miR-221，miR-451的表达均有所下降。miR-1在心脏组织的表达非常丰富，对心脏的发育有非常重要的影响，过表达miR-1可引起心室扩大及心力衰竭。miR-1可以与细胞骨骼调节蛋白Twf1（Twf1）相结合，它可以通过与肌动蛋白单体结合妨碍肌动蛋白的聚合。还有报导发现胰岛素样生长因子-1（IGF-1）是miR-1的靶点之一，心肌肥厚模型的miR-1表达下降，而IGF-1的表达则增加。miR-133在心肌肥厚的细胞及动物模型的表达水平均呈下降趋势，而钙调磷酸酶的水平则明显下降，提示钙调磷酸酶可能为其直接靶点。胸主动脉缩窄大鼠心肌肥厚模型术后不同时点芯片检测显示多种miRNA的表达上调或下调，术后第5天TAC组miR-451的表达量为假手术组的6.6％，而miR-29a则降至52.6%。
　　目的：
　　1.明确不同类型的心肌肥厚中miR-451a的表达水平变化;
　　2.观察应用外源性miR-451a模拟物及阻遏物后对ISO诱导的心肌细胞肥大的效应;
　　3.为miR-451a作为心肌肥厚的生物标志物及治疗靶点提供理论依据。
　　方法：将24只Sprague-Dawley（SD）大鼠随机分为2组，分为腹主动脉缩窄（AAC）组和假手术（Sham）组。AAC组通过腹主动脉缩窄术建立大鼠心肌肥厚模型。建模6周后测定各组大鼠左室射血分数EF、舒张期室间隔厚度IVSd、收缩期室间隔厚度IVSs、舒张期左室后壁厚度LVPWd、收缩期左室后壁厚度LVPWs、收缩期左室内径LVDs、舒张期左室内径LVDd，计算心肌肥厚指数(HWI和LVWI)，观察心肌组织病理学变化，应用荧光定量逆转录-聚合酶反应检测大鼠左心室心肌组织miR-451a及心肌肥厚标志分子心房钠尿肽（ANF）、脑钠尿肽（BNP）、β肌球蛋白重链（β-MHC）编码基因的表达变化。此外，使用蛋白印迹检测自噬标志分子LC3 II/I（LC3)的比值。
　　1．SD乳鼠心肌细胞分为2组，即空白对照组及异丙肾上腺素组（ISO），用qRT-PCR检测miR-451a及心肌肥厚标志分子编码基因的表达变化，免疫荧光检测细胞表面积变化及蛋白印迹检测自噬标志分子LC3II/I的比值。
　　2．SD乳鼠心肌细胞分为4组，即miRNA mimic阴性对照（miRNA mimic Negative Control）组、miRNA inhibitor阴性对照(miRNA inhibitor Negative Control）组、miR-451a mimic组和miR-451a inhibitor组，分别转染SD乳鼠心肌细胞24h后，予ISO处理48h，用qRT-PCR检测心肌肥厚标志分子编码基因的表达变化，免疫荧光检测细胞表面积变化及蛋白印迹检测自噬标志分子LC3II/I的比值。
　　结果：
　　1．超声心动图结果显示，与Sham组相比，AAC组的舒张期室间隔厚度、收缩期室间隔厚度、舒张期左室后壁厚度、收缩期左室后壁厚度、心脏肥厚指数显著升高，收缩期左室内径、舒张期左室内径、左室射血分数则明显下降。qRT-PCR结果显示AAC组肥厚标志分子编码基因相对表达量明显高于Sham组，miR-451a的相对表达量则较Sham组明显下降。AAC组自噬蛋白LC3II/I的相对表达量明显大于假手术组。
　　2．qRT-PCR结果显示，ISO组SD乳鼠心肌细胞的miR-451的表达量显著低于空白对照组，肥厚标志分子编码基因相对表达量则明显升高。免疫荧光检测显示，ISO组SD乳鼠心肌细胞的表面积显著大于空白对照组。蛋白印迹检测显示，ISO组SD鼠心肌细胞的LC3II/I比值显著大于空白对照组。
　　3．qRT-PCR结果显示，miR-451a mimic组SD乳鼠心肌细胞经ISO处理后肥厚标志分子编码基因的相对表达量显著低于miRNA mimic阴性对照组(PANF,Pβ-MHC均<0.01，PBNP=0.022)，miR-451a inhibitor组SD乳鼠心肌细胞则高于miRNA inhibitor阴性对照组(PBNP,Pβ-MHC均<0.01，PANF=0.021)。免疫荧光检测显示，miR-451a mimic组SD乳鼠心肌细胞经ISO处理后细胞表面积显著低于miRNA mimic阴性对照组，miR-451a inhibitor组SD乳鼠心肌细胞表面积则高于miRNA inhibitor阴性对照组。蛋白印迹检测显示， miR-451a mimic组SD乳鼠心肌细胞经ISO处理后LC3II/I比值显著低于miRNA mimic阴性对照组，miR-451a inhibitor组SD乳鼠心肌细胞LC3II/I比值则高于miRNA inhibitor阴性对照组。
　　结论：
　　1．miR-451a在AAC心肌肥厚模型及ISO诱导心肌细胞肥大模型表达明显下调，伴细胞自噬活动增加;
　　2．.转染miR-451a模拟物能有效抑制ISO诱导的心肌细胞肥大，自噬活动减弱；相反miR-451a抑制物则加重ISO诱导的心肌细胞肥大，自噬活动增强；
　　3．本实验提示miR-451a在心肌肥厚的发生发挥重要作用，miR-451a可能成为心肌肥厚治疗的新靶点。