促融性质膜颗粒的制备及生物大分子和线粒体的递送

摘要

建立高效传递生物大分子和细胞器的方法，对于治疗多种疾病，例如苯丙酮尿症和线粒体疾病，具有重要意义。但是，目前传递生物大分子和细胞器的系统存在效率低、费时费力和生物安全性等问题。为克服上述缺点，本研究建立了一种不但能有效传递蛋白质，而且能高效转移线粒体的递送系统。首先，通过瞬时转染方法，获得表达水疱性口炎病毒糖蛋白（VSV-G）的Ad293细胞，然后利用机械挤压法，使表达VSV-G的细胞穿过孔径约为3μm的聚碳酸酯膜，并获得促融质膜颗粒，不表达VSV-G的Ad293细胞制备的质膜颗粒用作对照。共聚焦显微镜结果显示，胞质定位和线粒体定位的绿色荧光蛋白（EGFP、Mito-EGFP）均存在于质膜颗粒，但是核定位的绿色荧光蛋白（H2B-EGFP）在质膜颗粒中观察不到。相应地，qRT-PCR结果表明，质膜颗粒中的mRNA，microRNA和线粒体DNA只有微弱的减少，而核DNA几乎检测不到；而且，Western blot结果显示，与对照组相比，胞质蛋白和膜蛋白也只有微弱的减少，但核蛋白未检测到；线粒体DNA编码的蛋白表达水平检测结果显示，与正常细胞相比，质膜颗粒中蛋白表达量只有微微降低。另外，将携带红色荧光蛋白（DsRed）的促融质膜颗粒和靶细胞孵育，结果表明胞质蛋白DsRed被成功传递到40％的靶细胞中；利用可诱导CreER/loxP系统，将携带CreER的促融质膜颗粒与携带Cre报告质粒（CMV-DsRed-loxP2-EGFP）的靶细胞孵育，结果表明CreER蛋白质能够成功传递到靶细胞，介导loxP间的DNA重组，导致靶细胞由DsRed+变成EGFP+，证实胞质蛋白确实可以通过促融质膜颗粒进行递送。
　　另外，和促融质膜颗粒孵育5h后，20%的靶细胞检测到供体来源的线粒体。为了进一步检验供体线粒体的功能，以线粒体缺陷型HeLa细胞(Rho0)作为靶细胞，结果表明，与对照组相比，促融质膜颗粒添加组的HeLa细胞数量增加了一倍；与此相反，用R6G处理使线粒体功能缺失后，促融质膜颗粒未能促进Rho0细胞的生长，表明供体线粒体而不是质膜颗粒中的生物大分子对恢复Rho0细胞的线粒体活性是必须的。最后，MitoTracker染色和JC-1染色结果显示，Rho0细胞的线粒体形状和膜电位恢复到正常水平。这些实验结果表明，本研究成功建立了一种方便、高效传递蛋白质和线粒体的投递系统，VSV-G介导的促融质膜颗粒可能为线粒体相关疾病的治疗提供一条有效的途径。

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第1章 前言

1.1 递送系统的研究进展

1.2 水疱性口炎病毒糖蛋

1.3 Cre/loxP 系统的介绍

1.4 线粒体缺陷型细胞

1.5 线粒体相关疾病及其研究进展

1.6 本论文的目的和意义

第2章 材料与方法

2.1实验试剂和材料

2.2 仪器

2.3实验方法

第3章 实验结果与分析

3.1 促融性质膜颗粒的制备和表征

3.2 通过fPMVs介导的蛋白质传递

3.3 通过fPMVs介导的线粒体传递

3.4 线粒体缺陷型细胞Rho0 HeLa的培养

3.5 Rho0 HeLa 细胞线粒体功能的恢复

3.6 Rho0 HeLa 细胞线粒体功能的恢复依赖于线粒体的传递

第4章 总结与讨论

4.1 总结

4.2 讨论

第5章 创新与展望

5.1 创新性

5.2 展望

参考文献

附录一

致谢

在校期间科研情况

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