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摘要
Abstract
英语缩略词
第1章 前言
1.1 线粒体功能及线粒体相关疾病
1.1.1线粒体结构与起源
1.1.2线粒体与氧化磷酸化、电子呼吸、质子梯度、ROS的产生
1.1.3线粒体与细胞凋亡
1.1.4线粒体的动态平衡
1.1.5线粒体遗传性疾病
1.1.6线粒体功能障碍性疾病
1.2 线粒体相关疾病的治疗
1.2.1基因替代疗法：线粒体特异性基因转移技术
1.2.2细胞替代疗法
1.2.3线粒体替代疗法
1.3 胞质囊泡的形成与应用
1.3.1外泌体研究进展
1.3.2细胞挤膜制备质膜囊泡及应用于药物递送
1.3.3超速离心制备无核细胞及质膜囊泡
1.4 间充质干细胞及应用
1.4.1间充质干细胞简介
1.4.2间充质干细胞的应用及发展
1.4.3间充质干细胞的应用前景
1.5 衰老性肌萎缩的研究进展
1.6 研究思路与实验方案
第2章 材料与方法
2.1实验试剂和材料
2.1.1实验动物
Balb/c小鼠：购买于上海斯莱克实验动物中心，独立饲养、繁殖于IVC独立送风隔离鼠笼。喂养钴60辐射无菌饲料以及pH 4.0灭菌酸化水，自由摄食。鼠笼的温度为22-25℃，湿度为40%-70%，梯度压差为10-20 Pa。两到三天换一次垫料，一到两周用过氧乙酸泡鼠笼，保证鼠笼内的环境清洁。昼夜交替间隔为12 h。
2.1.2动物实验试剂与材料
2.1.3手术器械
2.1.4细胞实验试剂与耗材
2.2 仪器
2.3.1 细胞相关实验
2.3.2质膜囊泡的制备
2.3.3质膜囊泡表征实验
2.3.4溶酶体检测
2.3.5质膜囊泡的浓缩
2.3.6超速离心制备质膜囊泡
2.3.7动物实验
2.4统计学分析
第3章 实验结果与分析
3.1 质膜囊泡的制备和表征
3.1.1 PMVs的形态分析和物质检测
运用方案一对细胞BMSC挤膜，挤膜后获得的PMVs里面包含有各种生物活性物质和细胞器。本实验中，PMVs作为一种新的递送系统，递送生物活性物质与细胞器到另一个细胞中并表达。
成功制备PMV的关键在很大程度上取决于过滤器装置的组装（图3-1），通过推挤1 mL的PBS可以测试装置是否发生泄漏，当PBS流畅的通过过滤装置时，证明装置的组装是正确的。
图3-1：过滤器装置的组装。（A）实验所用聚酯碳酸膜。（B）直径为3 μm的核径迹蚀刻膜在20X的光学显微镜下观察。（C）将膜放置在过滤器的基座上。（D）装配有聚酯碳酸膜的过滤器。 Figure 3-1: Assembly of the filter unit. (A) Commercially available polycarbonate membranes. (B) Track-etched pores o...
接下来，为了检测PMVs的大小，使用3 μm的聚酯碳酸膜对BMSC进行挤膜，结果发现，快速挤压的方式能够减少膜碎片的产生。此外，在第一次挤压的介质中发现PMVs的尺寸都较小（小于1 μm），而在第二、三次的挤压介质中的PMVs明显比第一次的多和大，大小约在2 μm～5 μm之间。
图3-2：BMSC细胞产生的PMVs。（A）鼠来源的BMSCs细胞培养于六孔板中。（2）约5 x 105 BMSCs细胞消化下来并重悬于500 μL的培养基中。置于光学显微镜下观测拍照。（C）在连接过滤器的装置之前，将细胞悬浮液吸取入注射器中。（D）来源于BMSCs细胞的PMVs置入共聚焦皿中，然后在共聚焦显微镜下拍照。
Figure 3-2: Generation of PMVs from BMSCs.
另外，为了验证PMVs是否包含蛋白质，对BMSC转染胞质绿色荧光蛋白pEGFP-N1质粒，48小时后，对其进行挤膜。如图3-3所示，在荧光共聚焦显微镜下观察到胞质绿色荧光蛋白EGFP被包裹在了PMVs中。另外，为了验证PMVs中是否包含有线粒体，对BMSC细胞进行线粒体染色，然后对其进行挤膜，可以明显的看到PMVs里面包含有线粒体，但是有一些3 μm大的PMVs中没有显示有线粒体的存在，表明在机械挤压的过程中存在的某些约束阻止线粒体进入到PMVs中。为了进一步的检测PMVs中线粒体的膜电位是否正常...
Figure 3-3: Detection of PMV content by confocal microscopy. Plasma membrane vesicles (PMVs) were generated from (A) BMSCs transfected with pEGFP-N1 for 48 h to trace the cytoplasmically localized EGFP protein, (B) BMSCs stained with mitoch...
使用PMVs时，其浓缩过程是必须的。通过在室温条件下离心PMVs，去除上清后，重悬PMVs，放置在显微镜下检测，发现得到的PMVs是聚集成团的，如图3-4所示。这可能是由于细胞膜上的粘附因子所导致的。因此，为了阻止聚集现象的发生，向培养基中添加对细胞无明显毒性的PEI（2 μg/mL）试剂，PEI附着在细胞膜上，然后在对细胞进行机械挤膜和浓缩，结果显示PEI有效防止了在离心过程中PMVs的聚集，如图3-4所示。
图3-4：PMVs的浓缩。将约5 x 105 BMSCs细胞消化重悬在添加或不添加2 μg/mL 的PEI的培养基中，在室温下1200 g离心5分钟，之后重悬在100 μL的培养液中，放置在光学显微镜的40X油镜下检测。（A）PMVs离心后发生聚集可能是由于细胞膜粘附因子引起的。（B）加入PEI后，PMVs呈现单分散性概念图。（C）离心后聚集的PMVs。（D）加入带有正电荷的PEI后，PMVs在离心后呈现出较少的聚集现象。
Figure 3-4: Concentration of PMVs by centrifugation.
从上述结果中可以得到，本实验室成功制备了一种质膜囊泡，此质膜囊泡的直径大部分在2 μm～5 μm之间，里面包含有线粒体与胞质蛋白。另外，在离心浓缩PMVs时，加入PEI可以有效防止PMVs发生聚集。
3.1.2 超速离心制备PMVs的形态分析与物质检测
利用机械挤压法制备的质膜囊泡（PMVs），线粒体含量较少、大尺寸的囊泡较少及细胞碎片较多。为了制备更优良的质膜囊泡，实验选用Percoll密度梯度离心及细胞松弛素B处理细胞，实现化学去核，如图3-5所示。选用BHK-21细胞作为供体细胞，超速离心之后，对得到的胞质体进行DAPI和线粒体染色，结果表明超速离心之后细胞大部分去核，而且得到的胞质体里面含有大量的线粒体。
图3-5：BHK-21细胞的超速离心与线粒体染色。A: BHK-21细胞(约7x105)用MitoTracker-Green染料染色，置于Percoll梯度进行超速离心，收集离心管底部组分，清洗去除Percoll，用Hoechst 33342染色，然后用激光共聚焦显微镜检测。B：将A图放大后观测线粒体形态。
Figure 3-5: Super centrifugation of BHK-21 cells and staining of mitochondria.
A: BHK-21 cells (about 7x105) were stained with MitoTracker-Green and layered on top of a Percoll gradient for super centrifugation. The bottom fraction was collected and Percoll was removed by washing. The fraction was stained with Hoechst 33342, was...
选用BHK-21细胞进行超速离心后，对得到的胞质体进行DAPI和线粒体染色，虽然大部分的细胞已经去核，但是仍存在一些有核细胞，为了去除掉这些细胞核，选用5 μm的聚酯碳酸膜对其进行挤膜，然后收集获得的PMVs，置于共聚焦显微镜下检测，如图3-6所示。结果表明超离之后的BHK-21细胞通过5 μm的聚酯碳酸膜挤压过后，细胞基本无核，并且在PMVs含有大量的线粒体。
A: BHK-21 cells were stained with MitoTracker-Green and centrifuged in Percoll gradient. The bottom fraction was stained with Hoechst, extruded throught a 5-(m membrane and then examined by confocal microscopy. B: Morphology of mitochondria was reveal...
接下来，为了彻底去除胞质体中的细胞核，我们选用3 μm的聚酯碳酸膜对其进行挤膜，然后收集获得的PMVs，置于共聚焦显微镜下检测，如图3-7所示。结果表明通过3 μm的聚酯碳酸膜挤压过后，细胞核已被彻底去掉。
A: BHK-21 cells were stained with MitoTracker-Green and centrifuged in Percoll gradient. The bottom fraction was stained with Hoechst, extruded throught a 3-(m membrane and then examined by confocal microscopy. B: Morphology of mitochondria was reveal...
之后，为了检测所得到的胞质体内线粒体的膜电位，对其进行JC-1染色，然后再通过5 μm的聚酯碳酸膜挤压，收集获得的PMVs，置于共聚焦显微镜下检测，如图3-8所示。检测结果发现无论是在胞质体中还是在PMVs中都能够检测到很强的红色荧光，而绿色荧光很弱。表明其内存在的线粒体膜电位是正常的。
另外，对得到的胞质体进行Lyso-Tracker Red染色，结果表明在胞质体存在溶酶体。再通过5 μm的聚酯碳酸膜制备PMVs，置于共聚焦显微镜下检测。检测结果发现不管是在胞质体中还是在PMVs中都能检测到大量的溶酶体存在。
从上述结果可知，与单纯的机械挤压法相比，新方法制备的质膜囊泡大小更加均一，大尺寸的囊泡数量大大增加，细胞碎片显著减少。另外，PMVs里包含有大量的线粒体与溶酶体等细胞器，其线粒体的膜电位也是正常的。
3.2 PMVs介导的内吞
3.2.1 BHK-21细胞介导的PMVs内吞
为了检测细胞对PMVs的内吞，选用BHK-21细胞同时作为供体细胞和靶细胞。对DII染色过后的BHK-21细胞用环状RGD多肽脂肪修饰或者不修饰，之后超速离心通过5 μm的聚酯碳酸膜挤压，收集PMVs。最后在所获得的PMVs中加入或者不加入PHA-P,置入靶细胞BHK-21中。24小时后，进行Hoechst 33342染色于共聚焦显微镜下检测，如图3-10所示。检测结果发现没有经过任何处理的细胞制备成PMVs后投递到靶细胞中，靶细胞吞噬的PMVs很少，而且尺寸也很小；用RGD多肽脂肪处理过后制备成...
图3-11：BHK-21细胞对大尺寸PMVs的吞噬。BHK-21细胞用DiI染料染色，后用RGD多肽脂肪孵育30 min，制备PMVs，再与凝集素PHA-P孵育，然后加入BHK-21靶细胞中，24 h后，用Hoechst 33342染色，于激光共聚焦拍照观察，Z轴分析显示PMV定位于细胞内部。
Figure 3-11: Phagocytosis of large size PMVs by BHK-21 cells.
接下来为了检测不同的靶细胞对PMVs的内吞是否不同，选用L6与BMSC细胞为靶细胞，BHK-21仍为供体细胞，从图3-10所示，实验选用第四种处理方式。获得的PMVs投递到靶细胞中，24小时后进行检测，如图3-12所示。监测结果表明靶细胞里面吞噬进去了数量较多的PMVs，而且还吞噬进一些3～5 μm大的PMVs
图3-12：环状RGD多肽与PHA-P凝集素对L6和BMSC细胞内吞PMVs的影响。BHK-21细胞用DiI染料染色，后用环状RGD多肽脂肪孵育30 min，制备PMVs，再与凝集素PHA-P孵育，然后加入靶细胞L6（A）或BMSCs（B）中，24 h后，用Hoechst 33342染色，于激光共聚焦拍照观察。
Figure 3-12: Effects of RGD and PHA on phagocytosis of PMVs by BMSCs or L6 cells.
BHK-21 cells were stained with DiI and incubated with RGD-PEG-lipid for 30 min. PMVs were generated as in Figure 3-5. PMVs were incubated with PHA before being added into culture of L6（A）or BMSCs（B）cells. Cells were stained with Hoechst 33342 at 24 h ...
对L6细胞进行共聚焦显微镜的3D重建分析表明大颗粒的PMVs确实进入到了靶细胞里面，如图3-13所示。
图3-13：L6细胞对PMVs的吞噬。BHK-21细胞用DiI染料染色，后用环状RGD多肽脂肪孵育30 min，制备PMVs，再与凝集素PHA-P孵育，然后加入靶细胞L6中，24 h后，用Hoechst 33342染色，于激光共聚焦拍照观察，Z轴分析显示PMV定位于细胞内部。
Figure 3-13: Phagocytosis of large size PMVs by L6 cells.
BHK-21 cells were stained with DiI and incubated with RGD-PEG-lipid for 30 min. PMVs were generated as in Figure 3-5. PMVs were incubated with PHA before being added into culture of L6 cells. Cells were stained with Hoechst 33342 at 24 h and examined ...
对BMSC细胞进行共聚焦显微镜的3D重建分析表明大颗粒的PMVs确实进入到了靶细胞里面，如图3-14所示。
3.2.3 PMVs在靶细胞中的释放
3.3 PMVs的应用
3.3.1 PMVs对线粒体缺陷型细胞143B/Rho0细胞的治疗
3.3.2 细胞衰老模型的构建
Figure 3-17: SA-β-gal activity of L6 cells treated with various concentrations of H2O2.
综上所述，细胞在氧化应激条件下，细胞的体积变大，β-gal染色加深，表明细胞衰老模型建立成功。
3.3.2 肌肉损伤
为了检测PMVs是否在肌肉细胞中，把BMSCs细胞先进行DiI染色，随后制备成PMVs，通过离心浓缩，最终把PMVs重悬在约100 μL的培养液中。然后使用注射器把PMVs注射到小鼠的腓肠肌中，12小时后，把肌肉切下来进行冰冻切片并DAPI染色，放置于共聚焦显微镜下进行检测，如图3-19所示。实验结果表明，在肌纤维中观测到有红色荧光出现，说明PMVs可能通过内吞作用传递到了肌肉细胞质中。另外，在肌纤维的边缘也观测到了红色荧光（数据未显示），表明大部分的PMVs并没有被内吞进去，或者在注射12小时后...
第4章 总结与结论
4.1 总结
8.在前者条件下对供体细胞再进行GALA多肽脂肪修饰或不修饰，投递到靶细胞BMSCs中，在不同时间段可检测到用GALA多肽脂肪处理靶细胞中，线粒体释放量较多，但与对照组相比，无显著的差异。
9．将修饰过后制备的PMVs投递到线粒体缺陷细胞143B/Rho0共培养，实验组细胞的数量比对照组多了近两倍。表明PMVs中的线粒体是具有生物学功能。
10．标记有DiI的PMVs注射入小鼠腓肠肌后，发现在肌纤维中有红色荧光出现，说明PMVs可能通过内吞作用进入肌肉细胞。然而，在肌纤维的边缘也观测到了红色荧光，表明大部分的质膜囊泡并没有被内吞，或者注射12小时后内吞才刚刚开始。
4.2 结论
在本次实验中，运用超速离心与机械挤膜的方式制备PMVs，所获得到的PMVs与之前方法相比，新方法制备的PMVs大小更加均一，大尺寸的囊泡数量大大增加，细胞碎片显著减少。另外，PMVs里包含有大量的线粒体与溶酶体等细胞器，其线粒体的膜电位也是正常的；环状RGD多肽脂肪与PHA-P能够促进细胞的吞噬作用，而促融性GALA多肽脂肪对靶细胞中PMVs内容物的释放无显著效果；对线粒体缺陷细胞加入PMVs，结果表明PMVs中的线粒体具有一定的功能性，能够促进线粒体缺陷细胞的生长。另外，通过体内实验可以得知，P...
第5章 讨论与展望
5.1 讨论
线粒体在细胞生长过程中扮演着重要的作用，一旦线粒体功能紊乱就会导致各种多样的疾病，例如进行性神经退行性疾病、肌肉病及心肌病等[169-170]。因此，替换受损的线粒体是至关重要的。此外，与干细胞不同的是，无核的PMVs不能增殖，因此它不太可能引起癌症的发生。最后，因为PMVs中缺乏核DNA，所以PMV在投递到细胞中时，会很大程度上降低由DNA随机整合而引发的基因突变，而且这种基因的突变往往是不可逆转的。
5.2 展望
参考文献
致谢
在校期间科研情况
个人简历
