苦参碱诱导K562细胞γ珠蛋白基因表达和向红系分化的研究

摘要

研究背景及目的: β珠蛋白生成障碍性贫血(βthalassemia)是世界上最常见的常染色体单基因缺陷所致的遗传性疾病，也是对人类健康影响最大的慢性溶血性贫血病，其分子病理基础是由于β珠蛋白基因的突变或缺失，造成α珠蛋白肽链与非α珠蛋白肽链之间的不平衡，过剩的α肽链造成红细胞成熟缺陷和无效生成，最终使患者出现溶血性贫血。本病在世界范围内分布广，发病率高，危害大，长期以来珠蛋白一直是生物医学领域研究的热点之一，常被作为遗传病的重要范例。目前除通过社区筛查、遗传咨询和产前诊断等预防手段控制患者出生外，至今对重型和部分中间型β珠蛋白生成障碍性贫血患者的治疗仍有较大难度：规律输血并配合除铁剂，平均寿命仅达30岁左右；脾切除及脾动脉栓塞只对部分中间型β珠蛋白生成障碍性贫血患者有一定的疗效；造血干细胞移植能够根治，但相合配型的供体难寻、移植难度大而又费用高昂，限制了其广泛应用；目前最有前景的治疗方法是基因治疗(gene therapy)，广义的基因治疗包括基因矫正治疗和基因调控治疗，基因矫正治疗是指运用DNA重组技术修复患者细胞中有缺陷的基因，使细胞恢复功能而达到治疗遗传病的目的；理论上β珠蛋白生成障碍性贫血此类单基因遗传病是基因矫正治疗最理想的模型，但因诸多技术难题至今尚未解决，目前仍停留于基础研究阶段。 研究方法: 一、苦参碱对K562细胞增殖抑制与诱导向红系分化的研究方法 1．苦参碱对K562细胞增殖抑制的影响：K562细胞培养于RPMI-1640完全培养基中，在37℃、5％CO<,2>条件下培养。①台盼蓝拒染活细胞计数：取指数生长期K562细胞，以5×10<'4>cells/mL密度接种于培养瓶中。分设苦参碱浓度为0.05g/L、0.10g/L和0.20g/L的3个实验组，只加等量培养液的阴性对照组和丁酸钠浓度为0.5mmol/L的阳性对照组。从接种当时起每隔24 h取部分细胞进行台盼蓝拒染活细胞计数，连续计数6d。②XTT法：取指数生长期K562细胞，制成1×10<'4>cells/mL的细胞悬液，设培养液组(只加培养液-本底背景)、苦参碱组(浓度分别为o0.05g/L、0.10g/L和0.20g/L)、阴性对照组(未加任何药处理)和阳性对照组(丁酸钠浓度为0.5mmol/L)，于d 3检测苦参碱对K562细胞增殖抑制的剂量效应。 2．苦参碱诱导K562细胞向红系分化的影响：①联苯胺染色检测苦参碱诱导K562细胞血红蛋白的表达：细胞培养及实验分组见台盼蓝拒染活细胞计数，从接种当时起每隔24 h先进行台盼蓝拒染活细胞计数，细胞活力在95％以上时，再取部分细胞进行联苯胺染色，计算联苯胺染色阳性细胞率(BZ％)，连续计数6 d。②Wright-Gimesa染色检测苦参碱诱导K562细胞的形态学变化：将阴性对照组及0.10g/L苦参碱诱导d 4的K562细胞，分别离心制作细胞涂片，观察细胞形态学上的改变。 二、苦参碱诱导K562细胞γ珠蛋白基因表达的研究方法 1．Western blotting检测苦参碱诱导K562细胞胎儿血红蛋白(HbF)的合成：做剂量效应时，收集0.05g/L、0.10g/L和0.20g/L浓度苦参碱和0.5mmol/L丁酸钠诱导d 4及阴性对照组K562细胞；做时间效应时，分别在d 3、d 4、d 5收集0.10g/L，苦参碱诱导后及阳性对照组、阴性对照组细胞。对上述收集的细胞提取总蛋白，先做蛋白定量，再以β-actin作为看家基因，应用Westem blotting获得各组HbF及相对应的β-actin的蛋白印迹结果，通过凝胶分析软件进行蛋白条带的灰度测定，用各组HbF条带的灰度值除以各自相对应的内参β-actin的灰度值，进行蛋白上样量的校正，再以校正后的阴性对照组的表达量作为“1”，计算出各组相对于阴性对照组的倍数，对所得倍数进行统计学处理。 2．实时荧光定量RT-PCR检测苦参碱诱导K562细胞γ珠蛋白基因mRNA的表达：采用相对定量解析方法进行mRNA表达量的分析。应用标准曲线进行样品间扩增效率校正；选择β-actin作为参比基因对所有样品进行归一化处理(RNA量校正)。制作标准曲线时以高浓度总RNA反转录后的cDNA作为样品，用EASY Dilution对样品进行10倍梯度稀释后，构建相对定量标准曲线。做剂量效应时，收集0.05g/L 0.10g/L和0.20g/L浓度苦参碱和0.5mmol/L丁酸钠诱导d3及阴性对照组细胞；做时间效应时，分别在d2、d3、d4时收集0.10g/L苦参碱诱导后及阳性对照组、阴性对照组细胞。对所收集的细胞提取总RNA，对其进行质量鉴定后，行实时荧光定量RT-PCR反应，调整待测样品浓度，使所得Ct值落在标准曲线上，然后与标准样品同时分管进行扩增，得到的各个目的基因及看家基因mRNA的Ct值分别代入各自对应的标准曲线。以看家基因的定量结果作为“1”，计算出各组相对于看家基因的倍数，即为误差校正后的总RNA量。再以校正后的阴性对照组的表达量作为“1”，计算出各组相对于阴性对照组的倍数，对所得倍数进行统计学处理。 结果: 一、苦参碱对K562细胞增殖抑制与诱导向红系分化的结果 1．苦参碱对K562细胞增殖抑制的影响：通过台盼蓝拒染活细胞计数和XTT法检测，苦参碱诱导K562细胞后不同时间之间有显著差异(P=0.000)；不同浓度苦参碱诱导后的细胞数之间有显著差异(P=0.000)。各浓度苦参碱对K562细胞增殖均有抑制作用，增殖抑制程度随苦参碱浓度的增大抑制作用增加。苦参碱能够以剂量依赖的方式抑制K562细胞的增殖。 2．苦参碱诱导K562~胞向红系分化的影响：①联苯胺染色检测苦参碱诱导K562细胞血红蛋白(Hb)合成：不同浓度苦参碱诱导不同时间联苯胺染色阳性细胞率(BZ％)有显著差异(P=0.000)。苦参碱能以剂量依赖和时间依赖的方式诱导K562细胞Hb合成，在0.10g/L浓度苦参碱诱导K562细胞d 4 BZ％达到高峰15.7％。②Wright-Gimesa染色检测苦参碱诱导K562细胞形态学变化：未诱导的K562细胞表现为未分化的祖细胞形态；诱导后的K562细胞在形态学上出现向红系分化的特征。 二、苦参碱诱导K562细胞Y珠蛋白基因表达的结果 1.Western blotting检测苦参碱诱导K562细胞胎儿血红蛋白(HbF)的合成：0.05g/L、0.10g/L和0.20g/L浓度的苦参碱及丁酸钠诱导K562细胞d 4 HbF合成增加倍数分别为1.08、1.53、1.36和1.52。0.10g/L、0.20g/L浓度的苦参碱与阴性对照间有显著差异(P<0.01)；0.10g/L浓度苦参碱诱导K562细胞d 3、d 4、d 5时及丁酸钠诱导d 3时HbF合成增加倍数分别为1.38、1.81、1.54、1.92。苦参碱诱导K562细胞d 3、d 4、d 5合成的HbF均与阴性对照组间有显著差异(P<0.01)。苦参碱能以剂量依赖和时间依赖的方式诱导K562细胞合成HbF。在0.10g/L浓度苦参碱诱导K562细胞d 4达到最佳剂量和时间效应。 2.实时荧光定量RT-PCR检测苦参碱诱导K562细胞γ，珠蛋白基因mRNA的表达：①<'A>γ珠蛋白基因mRNA的表达：各浓度苦参碱诱导K562细胞d 3及0.10g/L浓度苦参碱诱导K562细胞d 2、d3和d4时，γ珠蛋白基因mRNA的表达均与阴性对照组间无显著差异(P>0.05)。②<'G>γ珠蛋白基因mRNA的表达：0.05g/L、0.10g/L和0.20g/L浓度苦参碱及丁酸钠诱导K562细胞d 3 <'G>γ珠蛋白基因mRNA表达增加倍数分别为：1.40、2.72、2.20和3.39。O.10g/L、0.20g/L苦参碱与阴性对照间有显著差异(P<0.05)；苦参碱诱导d 2、d 3和d 4及丁酸钠诱导d 3时K562细胞<'G>γ珠蛋白基因mRNA表达增加倍数分别为1.57、3.08、2.54和3.45。3个不同天数的苦参碱诱导后的<'G>γ珠蛋白基因mRNA的表达均与阴性对照组间有显著差异(P<0.01)。故苦参碱能以剂量依赖及时间依赖的方式诱导K562细胞<'G>γ珠蛋白基因mRNA表达。在0.10g/L浓度苦参碱诱导K562细胞d 3达到最佳剂量和时间效应；苦参碱诱导K562细胞γ珠蛋白基因mRNA表达增加，主要是通过诱导<'G>γ珠蛋白基因mRNA表达增加实现的。 结论: 1．联苯胺染色显示：苦参碱能够以剂量依赖及时间依赖的方式诱导K562细胞血红蛋白的合成。 2．Westem blotting检测结果显示：苦参碱能够以剂量依赖及时间依赖的方式诱导K562细胞血红蛋白F的合成，这表明苦参碱通过诱导K562细胞血红蛋白F的表达而促使血红蛋白的合成。 3．实时荧光定量RT-PCR检测结果显示：苦参碱能够以剂量依赖及时间依赖的方式上调K562细胞<'G>γ珠蛋白mRNA表达，而对<'A>γ珠蛋白mRNA表达无明显作用。这表明苦参碱是通过上调<'G>γ珠蛋白mRNA的表达诱导K562细胞血红蛋白F的合成。 4．苦参碱能够诱导K562细胞向红系分化，具有与丁酸钠相同的诱导γ珠蛋白基因的表达，是一种低毒、价廉的γ珠蛋白基因诱导剂。 5．本研究为药物诱导调控治疗β珠蛋白生成障碍性贫血提供基础实验依据。

目录

文摘

英文文摘

声明

前言

第一部分苦参碱对K562细胞增殖抑制与诱导向红系分化的研究

1材料与方法

1.1材料

1.2实验方法

2结果

2.1苦参碱对K562细胞生长的影响

2.2苦参碱诱导K562细胞向红系分化的影响

3讨论

4结论

第二部分苦参碱诱导K562细胞γ珠蛋白基因表达的研究

1材料与方法

1.1材料

1.2实验方法

2结果

2.1联苯胺染色检测苦参碱诱导K562细胞血红蛋白的合成

2.2 Western blotting检测苦参碱诱导K562细胞胎儿血红蛋白的合成

2.3实时荧光定量RT-PCR检测苦参碱诱导K562细胞γ珠蛋白基因mRNA的表达

3讨论

4结论

全文小结

参考文献

附录

成果

1、论文发表

2、专利

致谢