CD25单克隆抗体防治大鼠角膜移植免疫排斥反应的实验研究

摘要

角膜移植是对因圆锥角膜、角膜变性、角膜营养不良、角膜瘢痕及角膜炎症等疾病导致角膜盲病人实行的一种复明手术。由于正常角膜不含血管和淋巴管，处于相对的免疫“赦免”区，因而角膜移植术后的免疫排斥反应发生率较低；但对于高危角膜(角膜新生血管，炎症等)来说，因其免疫“赦免”状态被破坏，术后排斥发生率较高。虽然角膜移植是最为成功的器官移植手术之一，但术后排斥反应仍是手术失败的最主要原因。角膜移植免疫排斥反应是一个相当复杂的免疫反应过程，其具体发病机制仍不明确。 根据以上所述，本课题拟进行如下研究： (1)研究效应性Thh1／Th2因子(IFN-γ／IL-4)在角膜移植免疫排斥反应中的作用。 (2)研究CD4+CD25+Tr(FOXP3)在角膜移植免疫排斥反应中的作用。 (3)探讨应用CD25单克隆抗体／及联合糖皮质激素在防治角膜移植免疫排斥反应中对效应性Th1／Th2因子(IFN-γ／IL-4)的影响。 (4)探讨应用CD25单克隆抗体／及联合糖皮质激素在防治角膜移植免疫排斥反应中对CD4+CD25-*Tr(FOXP3)的影响。 (5)探讨应用CD25单克隆抗体及联合糖皮质激素对角膜移植免疫排斥反应的防治效果和安全性。 (6)构建大鼠FOXP3真核表达载体，为进一步通过转基因治疗角膜移植免疫排斥反应的研究提供实验基础。 本课题的研究主要分为以下4部分： 第一部分：IFN-γ,IL-4与CD25在角膜移植免疫排斥反应中作用的实验研究 目的：探讨IFN-γ、IL-4与CD25在角膜移植免疫排斥反应中的作用。 方法：以Wistar大鼠为供体，SD大鼠为受体建立角膜移植实验模型。将57只SD大鼠随机分为3组，A组为正常组(9只)，B组(24只)和C组(24只)为Wistar-SD大鼠之间进行同种异体角膜移植组。术后分别球结膜下注射给药，B组给予生理盐水；C组给予地塞米松，100ug／次。 结果：C组发生排斥反应时间(16.417±1.379)天较B组发生排斥反应时间(10.583±1.084)天明显延迟，两组比较差异有统计学意义(P<0.05)。正常角膜无IFN-γ、CD25mRNA的表达，B组移植术后第11天角膜植片内IFN-γ、CD25mRNA的表达较C组明显增强(P<0.05)。 结论：CD25、IFN-γ和IL-4在角膜移植免疫排斥反应过程中发挥重要的作用；促进IL-4的表达，抑制IFN-γ及CD25的产生，对降低角膜移植免疫排斥反应具有积极的作用；术后动态检测外周血CD25和IFN-γ的表达有助于临床了解局部免疫反应的程度并预测角膜移植排斥反应的发生。 第二部分：FOXP3在角膜移植免疫排斥反应中作用的实验研究 目的：探讨FOXP3在角膜移植免疫排斥反应中的作用。 方法：以Wistar大鼠为供体，SD大鼠为受体建立角膜移植实验模型。将57只SD大鼠随机分为3组，A组为正常组(9只)，B组(24只)和C组(24只)为Wistar-SD大鼠之间进行同种异体角膜移植组。术后分别球结膜下注射给药，B组给予生理盐水；C组给予地塞米松，100ug/次。 结果：C组发生排斥反应时间(16.417±1.379)天较B组发生排斥反应时间(10.583±1.084)天明显延迟，两组比较差异有统计学意义(P<0.05)。正常角膜无FOXP3mRNA的表达，B组移植术后第11天角膜植片内FOXP3mRNA的表达较C组明显减弱(P<0.05)。B组：角膜移植术后CD4+CD25+T／CD4+T的表达在第11天(7.337±0.634)％明显高于术前(P<0.05)。 结论：FOXP3在角膜移植免疫排斥反应过程中发挥重要的作用；增强植片内FOXP3的表达和／或增加外周血CD4+CD25+Tf的含量有助于抑制角膜移植免疫排斥反应的发生。 第三部分：CD25单克隆抗体防治大鼠角膜移植免疫排斥反应的实验研究 目的：研究CD25单克隆抗体对角膜的毒性以及对效应性T细胞和调节性T细胞的影响，探讨其对大鼠角膜移植免疫排斥反应的防治效果。 方法： 1.将12只SD大鼠随机分为生理盐水对照组、50ugCD25单克隆抗体结膜下注射组、100ugCD25单克隆抗体结膜下注射组、200ugCD25单克隆抗体结膜下注射组，每组3只。各组大鼠均右眼用药，分别于0、2、4、6、8天结膜下注射生理盐水及不同剂量的CD25单克隆抗体，共5次。每日行裂隙灯显微镜检查，观察角膜有无水肿、混浊发生，并于第9天取右眼角膜行病理及透射电镜观察角膜各层的变化。 2.以Wistar大鼠为供体，SD大鼠为受体建立角膜移植实验模型。将93只SD大鼠随机分为五组，A组：正常组(9只)；B组：角膜移植对照组(24只)；C组：CD25单克隆抗体治疗组(18只)；D组：CD25单克隆抗体联合地塞米松治疗组(18只)；E组：地塞米松治疗组(24只)。B组：术后给予生理盐水：C组：术后给予CD25单克隆抗体100ug,D组：术后给予CD25单克隆抗体100ug联合地塞米松50ug治疗；E组：术后给予地塞米松100ug。 结果： 1.50ugCD25单克隆抗体和100ugCD25单克隆抗体对角膜基本无毒性影响；200ug的CD25单克隆抗体组透射电镜检查发现角膜基质细胞及内皮细胞有不同程度的肿胀。 2.C、D、E组发生排斥反应时间(分别为13.167±1.169,17.333±2.160，16.417±1.379)天较B组发生排斥反应时间(10.583±1.084)天明显延迟，差异有统计学意义(P<0.05)。正常角膜无IFN-γ、CD25和FOXP3mRNA的表达，术后第11天，B组移植角膜植片内IFN-γ、CD25mRNA的表达较C、D、E组明显增强(P<0.05)，C组FOXP3mRNA的表达较D、E组明显减弱(P<0.05)。 结论： 1.50ugCD25单克隆抗体和100ugCD25单克隆抗体对角膜基本无毒性影响。 2.效应性T细胞和调节性T细胞在角膜移植免疫排斥反应过程中均发挥重要的作用，抑制效应性T细胞、促进调节性T细胞的表达对防治角膜移植免疫排斥反应具有重要意义；CD25单克隆抗体在抑制效应性T细胞的同时，也抑制了调节性T细胞的功能；而CD25单克隆抗体联合小剂量地塞米松在抑制效应性T细胞的同时，又相对促进了调节性T细胞的表达，对防治角膜移植免疫排斥反应具有重要的临床应用价值。 第四部分：大鼠FoXP3基因的克隆及真核表达载体的构建 目的：构建大鼠FOXP3真核表达载体，为转基因治疗角膜移植免疫排斥反应提供实验基础。 方法：采用RT-PCR技术从SD大鼠脾脏扩增FOXP3基因，EcoRI、XhoI双酶切pcDNA3.1载体和FOXP3，DNA连接酶连接，构建pcDNA3.1-FOXP3真核表达载体，测序鉴定结果从大鼠脾细胞中成功克隆获得了1290bp的FOXP3基因，测序结果表明正确构建了含有FOXP3基因的pcDNA3.1-FOXP3真核表达载体。 结论：成功构建了真核表达载体pcDNA3.1-FOXP3，为进一步研究其对角膜移植免疫排斥反应的影响奠定了基础。 全文结论 1.IFN-γ、IL-4及CD25在角膜移植免疫反应的调节中发挥着重要的作用；检测外周血IFN-γ及CD25的表达可成为临床尽早诊治角膜移植排斥反应发生的重要手段；运用一定的方法，促进IL-4的表达，抑制IFN-γ及CD25的产生，对降低角膜移植免疫排斥反应具有积极的作用。 2.FOXP3在角膜移植免疫排斥反应过程中发挥重要的作用；增强植片内FOXP3的表达和／或增加外周血CD4+CD25+Tr的含量有助于抑制角膜移植免疫排斥反应的发生。 3.眼局部应用治疗剂量的CD25单克隆抗体(100ug内)对角膜基本无毒性影响。 4.降低Th1因子(IFN-γ)、促进Tb2因子(IL-4)的表达对抑制角膜移植免疫排斥反应的发生有一定的作用；但同时抑制Th1因子(IFN-γ)、Th2因子(IL-4)的表达，却更能有效的抑制角膜移植免疫排斥反应的发生，更有利于角膜植片的存活。 5.效应性T细胞和调节性T细胞在角膜移植免疫排斥反应过程中均发挥重要的作用，抑制效应性T细胞，促进调节性T细胞表达对防治角膜移植免疫排斥反应具有重要意义；CD25单克隆抗体在抑制了效应性T细胞同时，也抑制了调节性T细胞功能的发挥；CD25单克隆抗体联合小剂量地塞米松抑制效应性T细胞功能的同时，相对促进了调节性T细胞的表达，对防治角膜移植免疫排斥反应具有重要的临床应用价值。 6.成功构建了真核表达载体pcDNA3.1-FOXP3，为进一步通过局部或全身转染FOXP3基因，研究其对角膜移植免疫排斥反应的影响奠定了基础。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：中英文对照缩略词表

声明

前言

第一部分IFN-γ,IL-4与CD25在角膜移植免疫排斥反应中作用的实验研究

1.1材料和方法

1.2结果

1.3讨论

1.4参考文献

第二部分FOXP3在角膜移植免疫排斥反应中作用的实验研究

2.1材料和方法

2.2.结果

2.3讨论

2.4参考文献

第三部分CD25单克隆抗体防治大鼠角膜移植免疫排斥反应的实验研究

3.1材料和方法

3.2结果

3.3讨论

3.4参考文献

第四部分大鼠FOXP3基因的克隆及真核表达载体的构建

4.1材料与方法

4.2结果

4.3讨论

4.4参考文献：

全文结论

问题与展望

综述：Th1/Th2免疫应答与角膜移植免疫

在读期间投稿与发表文章

致谢

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