同种异体PRP应用于骨组织工程的实验研究

摘要

目的： 1.观察同种异体PRP释放物对体外培养的BMSCs增殖的影响。研究PRP促进BMSCs增殖与分化的量效关系，探索用于细胞培养及组织工程骨构建的最佳PRP浓度。 2.研究观察同种异体PRP凝胶用作骨植入物的免疫排斥反应，探讨同种异体PRP用于骨再生医学的可行性，为同种异体PRP凝胶用于临床骨修复提供基础。 3.验证同种异体PRP凝胶构建骨修复材料及组织工程骨修复骨缺损的效果，初步探讨PRP促进骨再生的机制。 方法： 1.以新西兰大白兔为实验动物模型，取心脏血提取PRP，分别检测PRP及全血中血小板数。无菌条件下抽取兔髂骨髓体外培养兔BMSCs，以培养的第3代BMSCs用于实验，分别以含自体与同种异体10％PRP萃取液的DMEM培养细胞分为自体PRP组、异体PRP组。倒置相差显微镜进行细胞形态学观察，于体外培养1，3，6天MTT法进行细胞增殖检测，评价同种异体PRP对BMSCs增殖的影响。 2.取第3代体外培养的兔BMSCs，分别配制含不同浓度同种异体PRP萃取液(1％、2.5％、5％、7.5％、lO％、15％、20％、30％、50％)的DMEM培养基，以不含PRP培养基为阴性对照，阳性对照为含10％FBS的培养基。以各培养基体外培养BMSCs分别于培养3，6，9天进行MTT检测，研究PRP对BMSCs增殖影响的量效关系。从碱性磷酸酶活性测定，碱性磷酸酶染色、钙沉积染色评价，评价不同浓度的PRP对MSCs的成骨分化的诱导作用。 3.新西兰大白兔12只，共分为A、B两组，A组4只，B组8只。A组为同种异体PRP凝胶肌内注射组，A组动物于双侧臀大肌内注射同种异体PRP凝胶各1.0ml，B组为骨缺损动物模型组，8只动物随机分为B1、B2两组，每组4只，制作右桡骨缺损1.5cm模型，B1组以同种异体PRP凝胶+植骨材料修复骨缺损，B2组为单纯植骨材料修复组。两组动物分别于处理(肌注同种异体PRP凝胶或植入异体PRP凝胶复合材料)前3天，处理后1、4、12周后观察一般情况，伤口愈合情况，并抽外周血以流式细胞术检测CD4、CD8淋巴细胞亚群，局部组织学观察及免疫组织化学染色检查，评价同种异体PRP凝胶用作植骨材料局部应用的免疫反应。 4.制备兔桡骨骨与骨膜缺损1.5cm骨缺损动物模型。24只新西兰兔随机分为A，B组，每组12只。各组双前肢骨缺损分别以四种植骨材料修复：A组分两个亚组。左侧桡骨缺损处植入体外培养的BMSCs与脱蛋白骨支架构建的组织工程骨(DPB+BMSCs)材料，记为A1组。右侧为PRP复合DPB+BMSCs构建的组织工程骨(PRP+DPB+BMSCs)，为A2组；B组左侧桡骨缺损处植入单纯脱蛋白骨(DPB)材料，为B1组；右侧为PRP复合脱蛋白骨(PRP+DPB)，即B2组。术后观察一般情况，伤口愈合等，于4、8、12W每组随机取4只活体检测骨缺损区骨密度，ECT检查ROI平均计数，于各时间点分别处死4只动物取出骨缺损区标本进行大体观察，X线照片和组织学切片观察，图像分析软件计算骨缺损区域成骨面积，评价同种异体PRP凝胶复合材料对骨再生的影响。 结果： 1.所制备的PRP中血小板数为全血中4.12倍。同种异体PRP培养组细胞生长良好，细胞形态正常，与自体PRP培养组无明显差异。随培养时间的延长，各组D570值逐渐增加(F=128.197，P=0.000)。两组间于培养1，3，6天各时间点OD570无显著性差异(相应的t=0.090，-0.109，0.175，P值分别为P=0.93、0.916、0.865)。 2.在观察期内，各实验组与阴性对照组相比，1％浓度组无明显促细胞增殖作用(P=0.814)，而其他各组(2.5％、5％、7.5％、10％、15％、20％、30％、50％)OD570值与阴性对照组相比，均有显著性增高(P<0.01)。与阳性对照组相比，1％，2.5％两组OD570值均明显较低，其差别有统计学意义(P<0.001)，5％，7.5％组OD570与阳性对照组无显著性差别(P值分别为0.093，0.753)。 3.各组间ALP差别有统计学意义(F=15.709，P=0.000)。各时间点间ALP活性差别也有统计学意义(F=89.244，P=0.000)。 4.一般情况观察肌内注射及手术植入同种异体PRP凝胶后未见动物有发热，皮下淤血、伤口渗液，延迟愈合等现象。淋巴细胞亚群监测结果：肌内注射同种异体PRP凝胶后不同时间点间CD4、CD8淋巴细胞数与注射前相比有轻度升高，CD4/CD8稍降低，但其差异均无显著性意义(P>0.05). 5.骨缺损修复术后所有动物无明显并发症。从大体标本及X线片观察术后4、8周时A2、B2组骨缺损处骨愈合情况及骨痂生成明显优于A1，B1组。 结论： 1.同种异体PRP对BMSCs增殖的影响与自体PRP无明显差别。PRP对体外培养BMSCs增殖影响存在较复杂的量效关系，在一定浓度范围内随PRP浓度的增加，其促细胞增殖作用更明显，但随浓度的增高，其促细胞增殖活力下降。其促进BMSCs向成骨分化的能力依赖于作用时间，长期低浓度PRP有利于促进BMSCs向成骨分化。 2.同种异体PRP凝胶用作植入材料免疫原性低，未引起明显免疫排斥反应。仅在植入后早期(1周)有淋巴细胞亚群变化，并有局部淋巴细胞及单核细胞浸润，无慢性免疫排斥反应。同种异体PRP凝胶用作骨修复材料可能是一种安全有效的选择。 3.异体PRP凝胶可促进骨组织再生，复合同种异体PRP凝胶的DPB骨修复材料及附载BMSCs构建的组织工程骨修复骨缺损有较好效果，具有良好的临床应用前景。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：中英文缩略词表

声明

前言

第一部分同种异体PRP对兔BMSCs增殖与成骨分化的量效关系研究

1材料与方法

2结果

3讨论

参考文献

第二部分 同种异体PRP凝胶局部应用的免疫反应观察

1材料与方法

2结果

3讨论

参考文献

第三部分 复合同种异体PRP的组织工程骨修复兔桡骨缺损的实验研究

1材料与方法

2结果

3讨论

参考文献

全文总结

综述 富血小板血浆在创伤修复中的作用及临床应用综述

攻读学位期间成果

致谢

统计学证明