同种异体脱蛋白骨复合纤维蛋白胶构建骨组织工程支架的实验研究

摘要

目的： (1)将纤维蛋白胶与脱蛋白骨复合，观察骨髓基质干细胞(BMSC)在复合材料中的生长、分化情况； (2)探讨复合纤维蛋白胶的脱蛋白骨与单纯脱蛋白骨作为BMSC支架材料在兔肌袋中异位成骨情况的差异； (3)制作兔桡骨缺损模型，探讨复合纤维蛋白胶的脱蛋白骨与单纯脱蛋白骨作为BMSC支架材料在兔体内修复骨缺损情况的差异，为骨组织工程提供合适的复合支架材料。 方法： (1)脱蛋白骨的制备：取新西兰大白兔双侧髂骨松质部分加工成不同规格骨粒，经过氧化氢、氯仿一甲醇溶液、乙二胺及无水乙醇等化学物质处理后脱去大部分蛋白成分，冻干后Co<'60>照射消毒。通过骨髓穿刺获健康成年新西兰大白兔BMSC，体外常规原代培养，传代至第三代后用于实验接种，细胞数量约为5×10<'5>。实验组使用复合纤维蛋白胶的脱蛋白骨与BMSC复合培养，对照组用单纯脱蛋白骨与BMSC复合培养，取不同时间点进行光学显微镜观察、扫描电镜观察、细胞DNA含量检测及钙结节染色比较两组细胞的生长、分化情况。 (2)健康成年新西兰大白兔28只，随机分为实验组12只，对照组12只，空白组4只。实验组为脱蛋白骨+FG+BMSC，对照组为脱蛋白骨+BMSC，空白组为单纯脱蛋白骨组。实验组与对照组动物分别于术后4、8、12周取材作相关检查，空白组于术后2周、4周取材作相关检查。手术将各组材料分别植入兔背部肌袋内，取材后进行大体观察、X线检测、碱性磷酸酶(ALP)测定、生物力学检测及组织学检查比较各组异位成骨情况，并通过局部组织学淋巴细胞定量和全身免疫学CD4、CD8阳性细胞分析判定免疫反应情况。 (3)取新西兰大白兔20只，随机选18只做左右双侧桡骨缺损，分别为实验组和对照组，空白组2只。实验组为脱蛋白骨+FG+BMSC，对照组为脱蛋白骨+BMSC，空白组为单纯脱蛋白骨组。制作兔桡骨1.2cm缺损模型，手术予各组材料分别修复兔桡骨缺损，取术后4、8、12周进行大体观察、X线检测、碱性磷酸酶测定生物力学检测及组织学检查比较各组修复骨缺损情况。 结果： (1)倒置显微镜及扫描电镜可见实验组细胞粘附明显多于对照组，并成三维空间生长，随培养时间的延长，实验组附着细胞增殖及分泌均优于对照组。细胞总DNA含量测定结果实验组细胞DNA含量在各个时间点均多于对照组，4、7d时两组间比较有著性差异(P<0.05)。钙结节染色实验组细胞体外培养7d时可见部分区域红染的钙结节，对照组未见钙结节形成。 (2)植入术后各组动物一般情况正常，伤口Ⅰ期愈合。ALP活性测定经析因设计方差分析表明，实验组较对照组同一时间的ALP活性强(P<0.01)。X线检测表明术后4、8周时成骨组织块阻射率实验组均高于对照组。生物力学检测组织块抗压刚度显示实验组明显优于对照组。组织学检查，实验组术后4周标本可见大量新生软骨已向成熟骨组织转化；对照组标本仅有极少量的成熟骨组织。术后8周，实验组标本已大部分钙化为成熟的板层骨；对照组标本边缘仍见有软骨组织。使用图像分析软件对两组植入物的成骨量评分，使用SPSS统计学软件进行析因设计方差分析，结果实验组体内植入后4、8周时的成骨量高于对照组(P<0.01)，实验组与对照组植入体内8周时的成骨量均比各自4周时有显著增高(P<0.01)。随植入时间的延长，新骨更趋成熟。局部切片淋巴细胞计数显示各组均无免疫学反应，全身免疫学指标CD4、CD8阳性细胞分析表明实验组和对照组术后均无免疫反应发生。 (3)骨缺损修复术后动物一般情况正常，取材可见4周时实验组骨痂生长活跃，缺损基本修复，对照组缺损部分修复，8周时两组均已修复。X线检测表明术后4、8周时缺损处阻射率实验组均高于对照组，ALP活性测定经析因设计方差分析表明，实验组较对照组同一时间的ALP活性强(P<0.01)。生物力学检测三点弯曲实验显示实验组强度明显优于对照组。组织学检查，实验组术后4周骨成熟多于对照组。术后8周，实验组标本已大部分钙化为成熟的板层骨；对照组标本边缘仍见有软骨组织。使用图像分析软件对两组植入物的成骨量评分，使用SPSS统计学软件进行析因设计方差分析，结果实验组体内植入后4、8周时的成骨量高于对照组(P<0.01)。随植入时间的延长，修复更趋完善。 结论： (1)复合纤维蛋白胶的脱蛋白骨比单纯脱蛋白骨更有利于细胞的接种粘附，更适合细胞生长、分化，是BMSC的良好载体。 (2)复合纤维蛋白胶的脱蛋白骨其新骨形成速度明显快于单纯组，早期成骨量多于对照组。 (3)复合纤维蛋白胶的脱蛋白骨其修复骨缺损在修复速度和修复质量方面均优于单纯脱蛋白骨组，表明其可作为BMSC的复合型支架材料应用于骨组织工程的构建。

目录

文摘

英文文摘

声明

前言

第一章脱蛋白骨复合FG构建骨组织工程支架的体外实验

1材料与方法

2结果

3讨论

4小结

第二章异体脱蛋白骨复合FG体内异位成骨实验

1材料与方法

2结果

3讨论

4小结

第三章异体脱蛋白骨复合FG修复兔桡骨缺损实验

1材料与方法

2结果

3讨论

4小结

全文总结

参考文献

综述:生物衍生骨在骨组织工程中的应用

附录

硕士研究生期间论文发表情况

致谢