蝙蝠携带冠状病毒的分子流行病学研究

摘要

研究背景和目的: SARS爆发后，蝙蝠作为多种人兽共患病病毒的自然宿主越来越引起人们的重视。 1.蝙蝠种类多，分布广 蝙蝠隶属翼手目(Chiroptera)，是哺乳类中分布最广、数量最多的动物之一，全世界大约有17科180属，约960种，其中我国有7科29属107种。翼手目分两个亚目：大蝙蝠亚目(Megachiroptera)，又称狐蝠，我国有1科5属7种；小蝙蝠亚目(Microchiroptera)，即通常所说的蝙蝠，我国有6科24属100种。 除南北极外，蝙蝠在世界各地都有分布，包括在高纬度地区、荒凉的沙漠和孤立的岛屿上，甚至在撒哈拉大沙漠也有蝙蝠的活动。然而，大多数蝙蝠种类生活在热带和亚热带地区。蝙蝠物种丰富，分布广泛，寿命长，并有很强的飞行能力，其中一些蝙蝠种类还有长途迁移的习性。 蝙蝠与人类接触密切。有些蝙蝠就栖息在屋檐下，或是房屋的裂缝中；另外蝙蝠在觅食时经常会误闯入居民家中；一些旅游景点的岩洞中也居住有蝙蝠。在中医里面，菊头蝠的粪便被做成“夜明沙”用于治疗眼疾：在广东，果蝠被一些餐馆作为野味摆上餐桌；湖南一些地区则相信蝙蝠可以用来治疗癫痫。 2.蝙蝠与冠状病毒 2002～2003年爆发的SARS，在确定SARS冠状病毒(SARS-CoV)的动物源性后，香港大学微生物系和中科院的研究人员分别发表文章宣布从菊头蝠科的蝙蝠中检测出蝙蝠SARS样冠状病毒(Bat-SARSCoV)，与人SARS冠状病毒的核苷酸同源性>88％，并且从菊头蝠科的成员中检出很高的抗体阳性率。因此，研究人员将冠状病毒的自然宿主锁定在蝙蝠上，并对野生蝙蝠展开了一系列的研究，结果发现，蝙蝠所携带的冠状病毒基因多样性极其丰富，迄今为止已经从蝙蝠中发现了十几种新的冠状病毒。但是通过对冠状病毒与宿主受体结合的S蛋白基因编码区的同源性分析表明，bat-SARSCoV与SARS-CoVS基因的同源性仅为64％，因此，SARS-CoV的直接祖先还未被发现，其从感染动物宿主到感染人宿主的进化历程还没有完全搞清楚，对已发现的冠状病毒进行的系统进化分析也表明还有更多新的冠状病毒没有被发现，现在已知的可能只是自然界中的冠状病毒一个很小的子集。 鉴于蝙蝠携带冠状病毒基因型多态性丰富，以及蝙蝠的生态学特性，期望从中发现其他与SARS-CoV更为同源的冠状病毒，描绘出病毒在自然宿主中的详细进化历程，有助于预防和控制SARS的再次爆发流行。因此，我们从海南、广东和湖南省部分地区收集蝙蝠标本，利用免疫学和分子生物学检测技术对蝙蝠携带冠状病毒进行一次初步的分子流行病学调查。 研究方法: 1.蝙蝠标本的收集和处理 2007年5月至8月之间，在海南、广东和湖南省部分地区共收集蝙蝠468只。进行编号后，请广州大学生命科学院蝙蝠研究专家吴毅教授进行鉴定。采集蝙蝠的地方主要有废弃的房屋，或者房屋的缝隙、屋檐，以及野外阴湿的山洞。 ①血清的采集。主要用两种方法，后肢静脉采血和心脏采血。采集的血样4℃静置5h后，3000r/min离心10min，取上清，装在EP管中，编号，4℃运送回实验室，立即检测。 ②直肠样本的处理。通过无菌操作解剖蝙蝠，取肛门上端直肠组织标本约2～3cm，保存在含有RNAlater的冻存管中，4℃运输，回实验室后，立即检测或放入-70℃保存。 2.蝙蝠血清冠状病毒抗体的SPA-ELISA检测 ①利用葡萄球菌A蛋白(StaphylococcusproteinA，SPA)能够天然地与人及某些哺乳动物的IgG分子上的Fc片段结合的特性，建立了一种新的SPA-ELISA方法，用于检测蝙蝠血清冠状病毒抗体： ②利用建立的SPA-ELISA对海南、广东和湖南部分地区收集的蝙蝠血清进行检测。 3.蝙蝠肠道冠状病毒的RT-PCR检测 ①参考文献，以及对已知的冠状病毒序列进行比对，找到冠状病毒的保守序列设计引物。引物扩增的目的基因位于RNA依赖的RNA多聚酶编码区，能够扩增已知的大部分冠状病毒，包括蝙蝠冠状病毒； ②利用RT-PCR检测蝙蝠直肠样本中的冠状病毒。 4.测序和基因分析 ①对于扩增获得的目的基因进行测序； ②测序结果利用GeneBank的BLAST软件进行在线同源性分析； ③在GeneBank下载其他冠状病毒序列，利用ClustalW进行多序列比对分析； ④用MEGA4.0软件，采用Neighbor-Joining法，Jukes-Cantor模型做进化树分析。 5.质量控制 ①枪头、EP管、冻存管、手套等实验耗材均为一次性用品； ②逆转录过程采用的枪头、EP管和研磨器用DEPC处理，高温高压消毒，烤干后待用，以去除RNA酶污染： ③RNA的提取，RT-PCR的反应体系的试剂加样均在无菌间生物安全II级超净台进行操作，防止环境中RNA酶的污染； ④操作过程中，全程戴口罩、帽子，勤换手套，防止样本和试剂受到来自操作者携带的RNA酶污染； ⑤在RNA提取，RT-PCR，SPA-ELISA过程中均设立阳性对照和阴性对照。 三、研究结果: 1.蝙蝠的基本情况 本次研究在海南、广东和湖南3个省共收集蝙蝠468只，包括4个科，12个种。共收集血清样本274份，直肠样本468份。 2.蝙蝠血清冠状病毒抗体的检测情况 ①建立的SPA-ELISA检测方法快速、简便，检出浓度低，即使在野外的条件下也可以通过颜色的变化来简单判定结果；而且需要的血清量小，完全可以在不伤害动物的情况下完成检测； ②利用SPA-ELISA从采集的274份血清样本中检测出36份阳性，阳性率为13.14％(36/274)。冠状病毒抗体检出自4种蝙蝠，分别为普通长翼蝠20.45％(27/132)，中华菊头蝠11.11％(2/18)，中菊头蝠9.26％(5/54)，棕果蝠3.64％(2/55)。 3.蝙蝠肠道冠状病毒的检测情况 利用RT-PCR，从13份蝙蝠直肠样本中扩增获得目的基因片段，总阳性率为2.78％(13/468)。13份样本全部来自湖南省，包括2个科的4种蝙蝠。其中4份样本检出自普通长翼蝠，阳性率2.63％(4/152)；6份样本检出自中菊头蝠，阳性率3.85％(6/156)：2份样本检出自中华菊头蝠，阳性率6.90％(2/29)：1份样本来自小菊头蝠，阳性率16.67％(1/6)。 4.测序和基因分析结果 ①BLAST同源性比对结果，从普通长翼蝠检出2种冠状病毒bat-CoVHKU7与bat-CoV1A：从中菊头蝠和中华菊头蝠中都检测出2种冠状病毒，bat-CoVHKU2与bat-SARS-CoV：从小菊头蝠中检出bat-SARS-CoV： ②用软件ClustalW进行多序列比对分析和MAGA4.0构建进化树表明冠状病毒的基因多态性丰富，3种属于冠状病毒group1，1种属于group2。 结论: ①建立了的蝙蝠血清冠状病毒抗体SPA-ELISA检测方法： ②湖南地区的蝙蝠可携带冠状病毒，血清冠状病毒抗体阳性率为13.14％(36/274)，直肠冠状病毒阳性率2.78％(13/468)： ③与之前在中国其他地方蝙蝠中分离出的冠状病毒基因型相似，但来自不同的蝙蝠种类；第一次从中菊头蝠中检测到bat-CoVHKU2，第一次从普通长翼蝠中检测到bat-CoVHKU7，第一次从小菊头蝠和中菊头蝠检测到bat-SARS-CoV： ④通过基因分析发现，不同的蝙蝠种类携带不同基因型的冠状病毒，来自不同地方的同种蝙蝠携带的冠状病毒基因型相似； ⑤检测出的病毒基因多态性丰富，但SARS-CoV的直接祖先仍未被发现。

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