X线照射原代培养大鼠海马神经元后p35、p25的表达及Cdk5激酶活性变化

摘要

近年来，随着生活节奏的加快和人口老龄化，恶性肿瘤的患病率在全世界范围内大幅度提高，成为继心脑血管疾病之后的人类“第二大杀手”，严重危害人类健康。 放射治疗是恶性肿瘤的主要治疗手段之一，也是部分肿瘤的根治性手段。据1998年世界卫生组织统计，全身恶性肿瘤控制率为45%，手术占22%，放疗占18%。大约有超过70%的恶性肿瘤患者有过放疗的经历。然而，射线在杀灭肿瘤细胞的同时又不可避免地造成正常组织的损伤。放射性脑损伤（radiation brain injury，RBI）是一种由各种放疗所致的脑组织放射性反应综合征，是头颈部恶性肿瘤放射治疗后导致的严重远期并发症之一。随着肿瘤治疗水平的提高及患者生存期的不断延长，放射性脑损伤的发病率逐年上升，严重影响患者的生存质量、生存期和预后，甚至导致患者的死亡。但目前对放射性脑损伤的发病机制仍不明确，临床上也缺乏有效的治疗手段。因此，研究放射性脑损伤，探索新的治疗靶点具有重要的意义。 CDK5（Cyclin-dependent kinase5）是脯氨酸限定性丝/苏氨酸（Ser/Thr）蛋白激酶，是细胞周期素依赖蛋白激酶（Cyclin-dependent kinase）家族一特殊成员，其底物包括含Lys-Ser-Pro（KSP）样基序的MAP1b，含KSPXK的tau和KSPXX的神经丝蛋白等。与细胞周期素依赖性蛋白激酶家族其他成员不同的是，CDK5与细胞周期调节作用无关。尽管CDK5在大多数组织中表达，但是主要在神经系统中有活性，CDK5激酶激活主要限于神经系统，是因其调节亚基p35、p39特异地存在于中枢神经系统（central nervous system）中所致。CDK5在中枢神经系统发育中起关键作用，此外，CDK5参与突触功能、神经元的迁移及粘附、药物成瘾性及神经退行性变等多种神经功能调控。CDK5单独并不起作用，必须与p35、p39等调节亚基结合锚定于膜上，才能发挥作用。p35的裂解产物p25可能在调节CDK5活性中起重要作用，因为p25稳定性更高，导致持续激活CDK5，无节制地磷酸化其适宜底物。研究表明，神经元中CDK5-p25过表达导致神经元凋亡。此外，在神经元凋亡过程中，CDK5的表达及活性增加；在几种不同的模型中，抑制CDK5活性可以有效地减少神经元的坏死和凋亡。 由于CDK5活性和膜细胞骨架、粘附系统相联系，故认为CDK5在神经元内物质运输中发挥作用。通过磷酸化微管相关蛋白，CDK5可能作用于微管的动力学和轴浆运输。CDK5所致神经元细胞骨架的异常磷酸化可引起神经元的功能异常和死亡。所以认为p25可以引起CDK5异常激活，导致细胞骨架崩解和细胞内物质运输障碍，从而引发神经退变。p35裂解成p25可能是一个包括神经突起回缩，微管崩解和细胞凋亡连锁性病理反应的关键点。但是，CDK5促进细胞死亡的具体机制仍未明了。 可以肯定的是，CDK5在中枢神经系统发育及功能中起决定性作用；此外，诸多证据表明CDK5的过度激活参与神经退行性变过程。那么，CDK5异常激活是否参与RBI的发病过程，这都是值得探讨的未知数。基于此，我们用X射线30Gy单次照射培养至12天的海马神经元，用Western-blot方法检测CDK5的激活蛋白p35、p25的蛋白水平变化，然后进行抑制性干预实验，从而探讨CDK5调节异常是否参与RBI的发病过程。 [目的]研究X线照射培养大鼠海马神经元后p35、p25的表达及CDK5激酶活性变化，为放射性脑损伤的预防和治疗提供理论依据。 [方法] （1）以培养至第12天的大鼠海马神经元为实验对象，用30Gy X射线单次对其进行照射。 （2）分别在照射后3.5h、4h、5h、6h共4个时间点，用Western-blot检测CDK5的调节亚基p35、p25蛋白水平。 （3）在照射后24h，用DAPI染核方法检测海马神经元凋亡情况，观察CDK5抑制剂roscovitine对海马神经元放射性损伤的作用。 （4）实验数据根据计量资料以均数±标准差（x±s）表示，使用SPSS13.0软件进行统计分析。设检验标准α为0.05。 [结果] （1）Western-blot实验结果显示：p35（35KD）于照射后增加，差别有统计学意义（F（4，15）=19.338，P=0.000，N=4）；照射后3.5h组与对照组比较相比增加1.52倍，差别有统计学意义（P<0.001），照射后4h组增加量为对照组的1.44倍，差别有统计学意义（P<0.001）。p25（25KD）表达水平亦于照射后增加，差别有统计学意义（F（4，15）=6.617，P=0.003，N=4）；照射后6h组与对照组相比增加1.63倍，差别有统计学意义（P<0.001）。p35、p25表达水平的改变提示在X线照射原代培养海马神经元后，可能存在CDK5活性增加。 （2）凋亡实验显示：在照射前15min用CDK5抑制剂roscovitine（10μM）孵育原代培养海马神经元，可以部分保护照射诱导的海马神经元死亡（F（2，13.121）=146.226，P=0.000，N=9）。30Gy组在照射后24h核固缩百分数为（24.8%±3.97%），较0Gy组（1.82%±1.08%）有显著性差异（P<0.001）；30Gy+roscovitine组在照射后24h核固缩百分数为（7.74%±2.27%），较30Gy组有显著性差异（P<0.001），亦较0Gy组有显著性差异（P<0.001）。 [结论] （1）X线照射培养海马神经元后p35、p25蛋白表达增加，可能异常激活CDK5； （2）应用CDK5抑制剂roscovitine抑制CDK5活性可以显著减少X射线诱导的海马神经元死亡，提示CDK5异常激活可能参与放射性海马神经元损伤过程。

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