免疫抑制剂及凋亡细胞诱导移植免疫耐受的实验研究

摘要

研究背景:
　　 器官移植是目前治疗器官终末期疾病的最有效的治疗措施,但是移植术后的排斥反应仍是阻碍患者和移植物长期存活的主要因为,传统免疫抑制剂的应用虽然能够有效地抑制急性排斥反应,但是在移植物的慢性排斥方面仍是不能解决其根本因为,并且长期服用免疫抑制剂会增加患者感染、中毒、肿瘤等疾病的发生率,且费用昂贵。因此,解决器官移植术后排斥反应的关键在于诱导受者对供者移植物的免疫耐受,免疫耐受是机体免疫系统在接触某种抗原后所产生的对该抗原的特异性免疫无应答状态,一旦此种免疫无应答状态形成后便无需任何免疫抑制剂维持,从而从更本上解决移植后的排斥反应,达到移植物与宿主能够长期共存的目的。但是,目前摆在移植免疫学界的难题就是如何才能够诱导受者的移植免疫耐受?据此孙尔维等人提出了利用供体凋亡细胞诱导受者免疫耐受的假说。该假说认为凋亡细胞能主动性地调节机体的免疫功能,凋亡细胞通过给其 APC 主动性地传递吞噬信号“eat me signal”使得吞噬细胞能够快速摄取凋亡细胞并将其所携带的供者抗原被特异性地浓集与受者 APC 内,从而短时间内提供大量供者 MHC 抗原,有效地被受者APC提呈给T细胞,最终促进调节性T细胞(Treg)的产生,抑制辅助性T细胞的产生来诱导机体的免疫耐受。国外Fsdok等人也发现巨噬细胞大量吞噬凋亡细胞时,可以抑制一些炎性因子的分泌,促进了 TGF-β、IL-10 等一些免疫调节因子的产生。Voll 等人发现在细菌脂多糖刺激外周血淋巴细胞的反应中加入凋亡细胞不仅能够抑制IL-2、IL-1B、TNF-α 等炎性因子的分泌,而且能够促进免疫抑制因子 IL-10的产生。本课题组已经成功建立了供者凋亡细胞预输注诱导小动物心脏、肝脏移植免疫耐受模型,但是单纯输注凋亡细胞对大动物的移植模型诱导免疫耐受的作用并不明显,同样,国内外众多学者对诱导成年大动物移植免疫耐受进行了多次尝试,均没有理想的结果,但是凋亡细胞联合免疫抑制剂对大动物移植免疫耐受的诱导实验尚未见报道。
　　 本课题为国家自然科学基金(供者凋亡细胞诱导移植免疫耐受的机制)资助项目。本实验利用同种异基因小鼠皮肤移植作为移植模型,皮肤移植是目前可行的器官移植中排斥反应最为强烈的模型,因观察周期短,操作简便,手术成功率高,可控性强等诸多优点而被广泛应用于移植模型的建立；凋亡细胞的制备有多种方法,目前一般采用紫外线照射、抗体诱导、化疗药物诱导、射线诱导、激素诱导等方法,本实验采取地塞米松药物诱导法。地塞米松作为糖皮质激素类药物具有调节细胞生长、发育、死亡以达到维持机体组织细胞平衡稳定的作用。地塞米松诱导淋巴细胞及其它免疫细胞的凋亡较其它方法稳定、易操作已有较多文献报道。
　　 第一部分 地塞米松诱导供体胸腺细胞的凋亡的初步研究
　　 目的:摸索使用地塞米松作为诱导剂对小鼠胸腺细胞凋亡的诱导作用,为下一步实验找到一种稳定性高、可控性强、凋亡率高的诱导方法。
　　 方法:将健康成年小鼠胸腺研磨制成细胞悬液,用血球计数板计数后用RPMI-1640 完全培养基(含 10％胎牛血清)调整细胞浓度为1×106/ml,将所获细胞分装进 4 个培养皿中进行不同处理:一组置于紫外线灯下20cm处直接照射15分钟后 5％CO2 孵箱37℃恒温培养4小时。另外三组分别加入浓度为1×10-7M、2×10-5M、2×10-3M的地塞米松后置于5％CO2 孵箱37℃恒温培养6小时；将处理后的四组胸腺细胞悬液用 Annexin V-PI 试剂双染后,用流式细胞仪检测胸腺细胞的凋亡和坏死。
　　 结果:1、不同浓度地塞米松处理后的小鼠胸腺细胞凋亡率略有不同,经1×10-7M 浓度的DEX处理BALB/C 小鼠胸腺细胞后,用流式细胞仪检测其凋亡率为 53.72％；经2×10-5M 浓度的DEX处理BALB/C 小鼠胸腺细胞后,检测其凋亡率为58.46％; 经2×10-3M 浓度的DEX处理 BALB/C 小鼠胸腺细胞后,测得其凋亡率为 55.72％。
　　 2、在紫外线灯下20cm处直接照射15分钟后用5％CO2 孵箱37℃恒温培养4小时后的小鼠胸腺细胞,测得其凋亡率为50.29％,；
　　 结论:用地塞米松诱导小鼠胸腺细胞凋亡过程复杂、耗时较长,而紫外线照射法操作简便、耗时短。但是用地塞米松诱导的小鼠胸腺细胞凋亡率要高于紫外线照射法,且坏死细胞较少,结果稳定,容易控制,因2×10-5M 浓度的DEX处理 BALB/C 小鼠胸腺细胞凋亡率最高,故下一步实验给受者小鼠注射凋亡细胞采取 2×10-5M 浓度的地塞米松诱导。
　　 第二部分 免疫抑制剂及凋亡细胞对诱导小鼠皮肤移植免疫耐受的试验研究
　　 目的:探索供体凋亡细胞与免疫抑制剂对小鼠皮肤移植免疫耐受的作用
　　 方法:1、制备供体小鼠的胸腺凋亡细胞:采用研磨法获得供者小鼠的胸腺淋巴细胞悬液,经2×10-5M DEX 处理后放入 5％CO2 孵箱37℃恒温培养6小时后,获取供体小鼠的胸腺凋亡细胞用 Annexin V-PI 试剂双染后,流式细胞仪检测胸腺细胞的凋亡率；
　　 2、实验分组:将受者小鼠随机分为四组:PBS对照组、凋亡细胞组、雷帕霉素(RAPA)组、RAPA+凋亡细胞联合组。输注供体胸腺凋亡细胞组别的受者小鼠分别在术前7、3、1天经阴茎背静脉输注供体小鼠的凋亡细胞悬液；接受药物处理的受者小鼠在术前3天开始灌胃给予RAPA药物,1次/d,直到所有移植皮片完全坏死时停药；
　　 3、建立小鼠背对背皮肤移植模型:将修好的供者小鼠背部皮片采用6-8针间断垂直褥式外翻缝合固定在受者小鼠背部,盖上无菌敷料后创可贴加压包扎；
　　 4、术后观察:在行皮肤移植术后第5天打开包扎观察移植皮片存活情况,若植皮与宿主的背底部愈合,色泽一致,无炎症和充血,有毛的皮肤毛发生长良好,则认为未发生排斥反应.50％以上皮片结痂、变硬、坏死、脱落作为排斥标准。
　　 结果:1、自体皮肤移植(手术控制组)45 例,皮片存活时间>1 月的存活率为 95％(43/45)；
　　 2、受者小鼠术前分别预输注一次、两次、三次凋亡细胞比较移植皮片存活时间没有统计学差异 P>0.05,但是输注三次凋亡细胞的受者小鼠移植皮片存活时间呈明显延长趋势；
　　 3、C57→Babl/C 小鼠背一背皮肤移植手术82例,其中PBS组18例,平均存活时间6.8天；凋亡组共20例平均存活时间7.4天；RAPA 组共行手术22例,平均存活时间 10.36天；RAPA 联合凋亡细胞组共行22例,平均存活时间10.68 天。用 Kaplan-Meier统计方法分析后PBS对照组与凋亡细胞组移植皮片存活时间比较无统计学差异(P>0.05):RAPA组与PBS组比较有显著性统计学差异(P<0.01)；RAPA+凋亡细胞联用与单纯使用RAPA组比较无统计学差异(P>0.05);
　　 4、Babl/C→ C57 小鼠小鼠背一背皮肤移植手术78例,其中PBS组共18例,平均存活时间6.5天；凋亡组共20例,平均存活时间7.3天；RAPA 组共行手术19例,平均存活时间10.42天；RAPA联合凋亡细胞组共行21例,平均存活时间 10.52天。用Kaplan-Meier统计方法分析后PBS组与凋亡细胞组移植皮片存活时间比较无统计学差异(P>0.05),但是凋亡组较 PBS 组移植皮片呈延长趋势； RAPA+凋亡细胞联用与单纯使用RAPA组比较无统计学差异(P>0.05)。
　　 结论:1、分别输注 1 次、2次、凋亡细胞均对小鼠皮肤移植存活时间无明显延长,但是输注3次凋亡细胞对移植物存活时间有着明显的延长趋势；
　　 2、凋亡细胞对诱导同种异基因小鼠皮肤移植免疫耐受作用不明显。
　　 3、低剂量免疫抑制剂能够延长同种异基因小鼠的皮肤移植存活时间；
　　 4、免疫抑制剂联合凋亡细胞的协同作用在小鼠皮肤移植模型上效果不明显。
　　 第三部分:不同免疫抑制剂对全血中细胞因子分泌的机制研究
　　 目的:研究不同免疫抑制剂对全血细胞中不同细胞因子分泌的影响。方法:1.取样:取健康成人外周血加入不同浓度的免疫抑制剂培养6 h 后加入10μl 浓度为 0.15 μg/ml的佛波酯(PMA)和10 μl浓度为2.5 μg/ml的离子霉素(IONO),再培养 6 h(37℃,5％CO2)后离心(300 G,5 min),收集上清待测:
　　 2.利用用 Bio-Plex 悬浮蛋白芯片系统检测细胞因子的变化,比较不同免疫抑制剂组细胞因子的水平。
　　 3.统计:采用SPSS10.0 统计分析软件对数据进行统计分析。采用单向方差分析和LSD 检验比较实验组与对照组之间的差异,P<0.05有统计学意义
　　 结果:高浓度,中浓度的地塞米松(DEX)及环孢素 A(CsA)都能有效抑制MCP-1的分泌,而他克莫司(FK506)和麦考酚酸(MPA)不能有效抑制细胞因子的分泌。
　　 结论:DE X和CsA 可有效抑制MCP-1的分泌,而FK506和MPA对MCP-1的分泌没有影响。

目录

文摘

英文文摘

第一部分 地塞米松诱导供体胸腺细胞的凋亡

1.前言

2.材料与方法

3.实验结果

4.讨论

参考文献

第二部分 免疫抑制剂联合凋亡细胞对小鼠皮肤移植免疫耐受的研究

1.前言

2.材料和方法

3.结果

4.讨论

参考文献

附图

第三部分 不同免疫抑制剂对人全血中细胞因子的影响

1.前言

2.材料和方法:

3.结果

4.讨论

参考文献

综述 凋亡细胞对移植物抗排斥反应中的作用

参考文献

中英文对照缩略语词表

硕士期间发表的论文

致谢

统计学证明