限制性输液复苏孕兔产后失血性休克对肠缺血-再灌注损伤的研究

摘要

产后出血是目前我国孕产妇死亡的首要因为,基于孕产妇血容量高、血液高凝、对失血耐受性比正常成人强以及早期难以及时发现等生理特性,当患者分娩发生于家中或基层医院时,早期有时不能及时发现,由于上述因素及医疗条件的限制常导致产后出血呈非控制性状态,难以及时发现和处理,一旦出现明显临床症状时,往往已达到中重度休克程度,加上血源不易即刻到位,抢救难度较大,因此产科出血救治成功的关键在于彻底止血前失血性休克的治疗,特别是在院前期的治疗,孕产妇的死亡率是衡量一个国家经济水平的敏感指标之一,寻求理想的院前休克救治方案具有重要的临床和现实意义[3]。
　　 本研究将在既往动物试验研究的基础上,真实模拟产后出血,以分娩后6小时的产兔为动物模型,排除孕期胎盘血流灌注的影响,探讨限制性输液复苏孕兔产后非控制性失血性休克的安全性,同时通过检测肠粘膜微循环血量、血浆二胺氧化酶(DAO)活性、D-乳酸水平、肠粘膜病理形态学变化及上皮细胞凋亡指数、促凋亡基因Caspase-3和NF-κB活性、抑制凋亡基因Bcl-2和Bcl-xlmRNA表达、氧自由基以及炎症因子等的变化规律,观察限制性输液复苏对缺血-再灌注损伤后肠粘膜屏障的影响,深入讨论限制性输液复苏对肠缺血-再灌注损伤的作用及其分子机制,完善限制性输液复苏在产科失血性休克应用的理论基础,为限制性输液进一步应用于院前急救提供可靠依据。
　　 第一部分 限制性输液复苏孕兔产后失血性休克的模型建立及评价
　　 [目的]
　　 大量研究发现,限制性输液复苏较传统复苏方法比较可减少失血量,增加组织细胞的供氧能力,减少了机体因缺氧造成的各种并发症,提高了生存率,我们既往的研究也证实了这一点[3]。对于孕兔产后非控制性失血性休克这一模型,应用限制性输液复苏是否也像孕兔非控制性失血性休克模型一样减少能持续出血和休克并发症、提高生存率呢?我们比较了上述两种不同输液方法对产兔失血性休克的治疗效果,以探讨其对失血量、输液输血量、系统代谢、生存情况的影响以及相关血流动力学变化规律。
　　 [方法]
　　 1、实验动物40只孕晚期(28～32天)新西兰白兔,年龄2-2.5岁,产后6小时内建立动物失血性休克模型。
　　 2、建立孕兔产后失血性休克模型 经过麻醉动物、备皮、颈动脉及股动静脉插管,沿下腹部正中切口打开腹腔,暴露子宫,制作孕兔产后失血性休克模型。模型分为4期:①基础期(Omin)麻醉、插管操作完毕后15分钟,连续监测平均动脉压(Mean arterial pressure,MAP),记录基础期指标。②急性失血期(0～30min):选取产兔子宫系膜处的一处直径约3-4mm的动脉切断,使用无菌纱御围绕(便于统计出血量),然后颈动脉放血,速率2ml.kg-1.min-1,使MAP在15分钟内降至40mmHg,维持其在40～45mmHg之间15分钟,抽出的血液经肝素化处理以备回输。③院前复苏期(非控制性出血期):急性失血期后的30～90min期间。根据预先设定的输液方案给予抢救。④院内复苏期(止血控制期):当实验进行至90min后,缝扎血管彻底止血,回输血液和继续输液治疗以维持MAP在80mmHg,第180min分钟停止实验,拔除各插管,缝合伤口。放回笼内,自由饮水、进食,观察生存情况。
　　 3、实验分组 将实验动物编号,随机分为4组(每组10只):①对照1组(假休克组,P组),给予插管、开腹等处理后,但未进行放血和任何治疗。②对照2组(休克未处理组,P0组),经过失血处理后未给予任何抢救治疗。③治疗1组(传统输液组,PNL组),院前期开始接受大量的林格氏液快速输注,输液速度为12ml/min,维持MAP为80mmHg。④治疗2组(限制性输液复苏组,PLH组),院前复苏期开始输注同样的液体,输液速度为4ml/min,保持MAP不超过60mmHg。治疗组在院内复苏期开始接受同样的手术止血和输血输液治疗,维持MAP为80mmHg。
　　 4、监测指标；通过PcLab生物信号处理系统于0min、30 min、90min、120min、180min测定血流动力学指标并记录输血输液量,于实验0min、30min、90min、180min、4h抽血检测血乳酸水平(BL)、碱缺失(BD)、PH和红细胞比容(hematocrit,Hct)水平。BL、PH、BD用全自动血气分析仪监测。Hct测定采用CELL-DYN1400多参数血细胞分析仪,记录3h、24h、48h、72h产兔生存情况。
　　 第二部分 限制性输液复苏孕兔产后失血性休克对肠缺血-再灌注损伤的研究
　　 [目的]
　　 失血性休克后的液体复苏过程类似于缺血再灌注的病理生理改变,是失血性休克后继发组织损伤的一个重要因为。由于胃肠道代谢活跃、粘膜血管的发夹状结构和逆流交换机制使肠道成为休克、创伤时缺血发生最早、恢复最迟的器官。肠缺血再灌注损伤导致肠粘膜屏障损伤是一个极其复杂的过程,如何减少缺血再灌注时肠粘膜的损伤是研究的难点和热点。肠粘膜的血供特点及肠粘膜细胞的特点决定了肠粘膜屏障极易受损,作为肠粘膜屏障重要结构的粘膜细胞,在肠缺血再灌注损伤死亡时以细胞凋亡为主要形式[9]。细胞凋亡是在基因严格调控下的细胞程序性死亡,目前,肠缺血再灌注损伤时细胞凋亡的具体发生机理尚未阐明。因此,我们拟通过不同输液方法复苏孕兔产后失血性休克,探讨其对小肠粘膜屏障、肠粘膜上皮细胞凋亡等的影响,研究限制性输液复苏对缺血-再灌注后肠损伤的分子机制。
　　 [方法]
　　 1、实验动物24只孕晚期(28～32天)新西兰白兔,年龄2-2.5岁,产后6小时内建立动物失血性休克模型。
　　 2、建立孕兔产后失血性休克模型 经过麻醉动物、备皮、颈动脉及股动静脉插管,沿下腹部正中切口打开腹腔,暴露子宫,制作孕兔产后失血性休克模型。模型分为4期:①基础期(Omin)麻醉、插管操作完毕后15分钟,连续监测平均动脉压(Mean arterial pressure,MAP),记录基础期指标。②急性失血期(0～30min):选取产兔子宫系膜处的一处直径约3-4mm的动脉切断,使用无菌纱布围绕(便于统计出血量),然后颈动脉放血,速率2ml.kg-1.min-1,使MAP在15分钟内降至40mmHg,维持其在40～45mmHg之间15分钟,抽出的血液经肝素化处理以备回输。③院前复苏期(非控制性出血期):急性失血期后的30～90min期间。根据预先设定的输液方案给予抢救。④院内复苏期(止血控制期):当实验进行至90min后,缝扎血管彻底止血,回输血液和继续输液治疗以维持MAP在80mmHg,第180min分钟停止实验,拔除各插管,缝合伤口。第4h处死动物,结束实验。
　　 3、实验分组 将实验动物编号,随机分为4组(每组6只):①对照1组(假休克组,P组),给予插管、开腹等处理后,但未进行放血和任何治疗。②对照2组(休克未处理组,P0组),经过失血处理后未给予任何抢救治疗。③治疗1组(传统输液组,PNL组),院前期开始接受大量的林格氏液快速输注,输液速度为12ml/min,维持MAP为80mmHg。④治疗2组(限制性输液复苏组,PLH组),院前复苏期开始输注同样的液体,输液速度为4ml/min,保持MAP不超过60mmHg。治疗组在院内复苏期开始接受同样的手术止血和输血输液治疗,维持MAP为80mmHg。
　　 4、监测指标
　　 4.1 通过PcLab生物信号处理系统监测平均动脉压、心率、呼吸等指标。
　　 4.2 激光多普勒微循环监测仪持续检测肠粘膜微循环血流量:于0min、30min、60 min、90min、150min、180min记录小肠粘膜微循环血流量平均值。
　　 4.3 血浆DAO活性、D-乳酸水平:0min、90min、180min、4h抽血检测,采用分光光度计测定。
　　 4.4 TNF-α、IL-10:0min、30min、90min、180min、4h抽血离心取血清检测,采用双抗体夹心ELISA法测定。
　　 4.5 肠组织病理:第4h处死动物取距回盲部4cm的小肠组织,制成病理切片,光镜、电镜下观察小肠组织的形态结构改变,采用Chiu氏6级评分法行肠粘膜损伤程度评分。
　　 4.6 肠粘膜上皮细胞凋亡指数:TUNEL检测。
　　 4.7 肠组织SOD活性和MDA水平:采用分光光度计测定。
　　 4.8 肠组织caspase-3、NF-κB活性测定:采用ELISA法测定。
　　 4.9 肠组织Bcl-2、Bcl-xlmRNA表达:采用real time PCR检测,内对照选择GAPDH。
　　 [结论]
　　 休克发生后,肠粘膜细胞受损,细胞凋亡或细胞间通透性增加,肠粘膜屏障功能下降。限制性输液复苏较传统复苏较快恢复肠粘膜循环血流量,降低肠粘膜通透性,明显改善失血性休克时肠缺血再灌注后肠组织的病理损伤、降低肠粘膜损伤评分,保护了肠粘膜机械屏障。同时,限制性输液复苏能减少氧自由基产生,降低血清炎症因子水平,抑制凋亡基因的活化,促进抗凋亡基因的上调,从而减少肠粘膜上皮细胞凋亡发生,减轻肠缺血再灌注损伤。
　　 综上所述,本研究通过孕兔产后非控制性失血性休克模型,证实对产后失血性休克院前抢救时限制性输液较传统输液能提高产兔的生存时间,减轻复苏时大量输液带来的再灌注损伤,尤其是肠组织的缺血.再灌注损伤,进一步完善了限制性输液复苏在产科失血性休克应用的理论基础,为临床研究提供可靠依据。

目录

文摘

英文文摘

前言

第一部分 限制性输液复苏孕兔产后失血性休克的模型建立及评价

第一节 材料

第二节 方法

第三节 结果

第四节 讨论

第二部分 限制性输液复苏孕兔产后失血性休克对肠缺血-再灌注损伤的研究

第一节 材料

第二节 方法

第三节 结果

第四节 讨论

全文小结

参考文献

成果

致谢

统计学证明