骨肉瘤血管内皮细胞特异性结合肽的功能验证

摘要

研究背景：
　　 骨肉瘤是起源于间叶组织的恶性骨肿瘤,多发于儿童和青少年。现阶段大剂量的化疗是主要的治疗方法,该方法虽有效但无选择性,当化疗药物进入机体后,对正常的细胞亦有杀伤作用,引起了很严重的副作用。因此,增强化疗药物针对骨肉瘤组织的靶向性,成为目前急待解决的一个课题。肿瘤的血管生成是肿瘤发展的重要环节,肿瘤必须通过形成新的血管系统来提供足够的营养,以支持其继续生长,因此将肿瘤新生血管内皮上的某些特异性分子作为药物作用的新靶点,日益受到研究者的密切关注。为了获取能与上述靶点特异性结合的配体,必须具备有效的筛选手段。噬菌体展示技术的应用为实现此目的提供了一个全新的工具。
　　 噬菌体展示技术是20世纪90年代发展起来并得到广泛应用的新技术。采用该技术,可以在欲筛选的靶标分子结构不明确的情况下,无需事先知道它们之间相互作用的区域及相互作用的性质来进行筛选,从而筛选出一些能与靶分子结合的特异性短肽。近几年兴起的噬菌体体内展示技术更是创造性地将常规的噬菌体展示技术与动物模型相结合,是寻找组织、器官特异性结合多肽的有效手段。此方法可在受体分子尚不清楚的情况下,以受体天然存在的环境--组织器官为配基,利用噬菌体短肽的抗原特异性,寻找未知的靶分子,确定其结构域。
　　 本课题组管明强于2009年利用鼠骨肉瘤细胞UMR-106制作骨肉瘤裸鼠模型,然后利用噬菌体7肽肽库进行体内筛选,得到一条能特异性结合LIMR-106骨肉瘤血管内皮细胞的七肽(序列为:TKPDKGY),将表达该序列的噬菌体克隆进行体内回输验证发现,该克隆在鼠骨肉瘤组织的聚集显著高于其它正常组织,免疫组化亦显示该克隆在骨肉瘤血管内皮表面大量聚积,在心脏、肺脏、肾脏及脑组织内仅有少量的聚积,具有明显的鼠骨肉瘤血管内皮细胞特异亲合性,TKPDKGY有可能成为骨肉瘤血管靶向治疗的特异性短肽,为本研究的顺利进行奠定了良好的基础。
　　 目的：
　　 验证骨肉瘤血管内皮细胞特异性结合肽(TKPDKGY)对体外培养的骨肉瘤血管内皮细胞和荷瘤裸鼠模型体内的血管内皮细胞的亲和性。
　　 方法
　　 1.血管内皮细胞的原代培养与鉴定
　　 采取血管内壁贴壁消化法,分别进行裸鼠主动脉血管内皮细胞和骨肉瘤血管内皮细胞的原代培养,同时进行Ⅷ因子免疫组化鉴定。
　　 2.短肽靶向性的体外验证
　　 合成骨肉瘤血管内皮细胞特异性结合肽TKPDKGY,并在其N端加载荧光基团FITC。将短肽荧光复合物与OAVECs结合后于荧光显微镜和流式细胞仪下观察,同时以AECs和UMR-106细胞为对照组,以评估短肽针对OAVECs的靶向性。
　　 3.短肽靶向性的体内验证
　　 将前述合成的短肽荧光复合物注入动物血管内,通过小动物整体荧光成像来观察短肽在活体动物内的分布,同时定时处死动物,切取重要器官和肿瘤部位使用LSCM来评价其动物体内与OAVECs的亲和度。
　　 结果
　　 1.血管内皮细胞的原代培养与鉴定
　　 正常裸鼠于原代培养后的6d后可见明显内皮细胞集落,肿瘤血管内皮细胞则4d后即可见细胞集落。正常血管内皮细胞初期呈团块状排列,细胞较小但形态规则,呈短梭形、多角形或不规则形,核清晰,呈圆或椭圆形,细胞生长迅速。约7-9d后细胞汇合,胞体呈梭形或多角形,互相嵌合,细胞间界限不清。此时细胞生长缓慢,传3-4代时,细胞开始变性、变形、脱落,不再继续生长。OAVECs租AECs形态上无明显差别。Ⅷ因子免疫组化鉴定显示:两种细胞胞质均呈黄褐色着色(阳性细胞率:AECs 98％；OAVECs 99％),而不加单抗的对照组无特殊显色。
　　 2.短肽靶向性的体外验证
　　 荧光显微镜示OAVECs与FITC-TKPDKGY组荧光显微镜下细胞表面显示较强且清晰的荧光,表现出明显的结合；而AECs及UMR-106细胞与FITC-TKPDKGY组则在荧光显微镜下仅见微弱的荧光,且基本为背景荧光,细胞无特异性结合。
　　 流式细胞仪检测结果显示,FITC-TKPDKGY与UMR-106和AECs共孵育时,荧光标记的阳性细胞数百分比分别为0.27％和0.22％,而FITC-TKPDKGY与OAVECs共孵育时,荧光标记的阳性细胞数百分比为89.54％,荧光强度明显强于对照组；单纯FITC与三种细胞共孵育时,荧光标记的阳性细胞数百分比均小于1％。说明短肽TKPDKGY与OAVECs细胞具有较强的特异结合能力。
　　 3.短肽靶向性的体内验证
　　 小动物整体荧光成像实验显示:荷瘤裸鼠注射FITC-TKPDKGY 10min后,肿瘤处即可见荧光富集,但较为微弱,30min时显示明显并逐渐增强,1hr后达最强,4hr后逐渐消退,至24hr基本无荧光残留,而荷瘤裸鼠注射单纯FITC未见明显的肿瘤富集效应。LSCM扫描显示:注射短肽荧光复合物4hr后,肿瘤部位冰冻切片激光共聚焦扫描可见肿瘤血管和血管丛荧光强度较强；血管周围的肿瘤组织也可见少量短肽结合,但显示并不明显,可提示有一定的结合性。心、脑、肺和肝组织显示并不明显。肾脏大部荧光强度较低,镜下可见肾血管并无荧光富集,但肾小球和肾小管部可见荧光富集,且与周围组织对比明显,提示短肽在此因代谢而富集。FITC注射组各部位未见特异性结合。
　　 结论
　　 本研究在已通过噬菌体体内展示技术获得骨肉瘤血管内皮细胞特异性结合肽的基础上,从体外和体内两个角度,对此短肽针对骨肉瘤血管内皮的靶向特异性进行了评价。结果显示在无论在体内还是体外试验中,短肽均显示可很好的靶向结合骨肉瘤血管内皮细胞,同时并不特异性结合其他机体内正常组织,为该特异性短肽进一步结合效应分子应用于骨肉瘤的诊断和治疗奠定了一定的实验基础。通过以上研究,我们得出以下几点结论:
　　 1.成功复制了骨肉瘤荷瘤裸鼠模型；
　　 2.血管内壁贴壁消化法为一种较简易,成功率较高的血管内皮细胞原代培养方法；
　　 3.通过荧光示踪技术和流式细胞技术检测了短肽针对体外培养的骨肉瘤血管内皮细胞的特异结合性,证实骨肉瘤血管内皮细胞是此短肽的靶向细胞；
　　 4.通过小动物整体成像仪和LSCM对短肽针对荷瘤裸鼠模型内骨肉瘤血管内皮组织的靶向性进行评价,发现短肽很好的保持了生物学活性,显示与骨肉瘤血管内皮组织有着良好的结合特异性。

目录

文摘

英文文摘

前言

第一章 裸鼠血管内皮细胞和骨肉瘤血管内皮细胞原代培养

1.1 材料与方法

1.1.1 材料

1.1.2 主要试剂

1.1.3 试剂的配制与包被方法

1.1.4 裸鼠血管内皮细胞的原代培养方法

1.1.5 骨肉瘤血管内皮细胞的原代培养方法

1.1.6 正常血管内皮细胞和骨肉瘤血管内皮细胞的免疫组化鉴定

1.2 结果

1.2.1 血管内皮细胞体外培养倒置显微镜观察

1.2.2 正常血管内皮细胞和骨肉瘤血管内皮细胞的免疫组化鉴定

1.3 讨论

第二章 骨肉瘤血管内皮细胞特异性结合肽的体外功能验证

2.1 材料

2.1.1 主要试剂

2.1.2 试剂配制与多肽合成

2.1.3 细胞株和实验动物

2.1.4 主要仪器

2.2 方法

2.2.1 荧光显微镜观察FITC-TKPDKGY与骨肉瘤血管内皮细胞结合

2.2.2 流式细胞仪检测FITC-TKPDKGY与骨肉瘤血管内皮细胞的结合特异性

2.3 结果

2.3.1 荧光显微镜观察FITC-TKPDKGY与骨肉瘤血管内皮细胞结合

2.3.2 流式细胞仪检测FITC-TKPDKGY与骨肉瘤血管内皮细胞结合

2.4 讨论

2.5 小结

第三章 骨肉瘤血管内皮细胞特异性结合肽的体内功能验证

3.1 材料

3.1.1 主要试剂:

3.1.2 试剂配制

3.1.3 细胞株和实验动物

3.1.4 主要仪器

3.2 方法

3.2.1 小动物整体荧光成像仪扫描

3.2.2 激光共聚焦显微镜扫描

3.3 结果

3.3.1 小动物整体荧光成像仪扫描

3.3.2 激光共聚焦显微镜扫描

3.4 讨论

3.5 小结

结论

参考文献

附录1 综述

参考文献

附录2 英文缩略词表

攻读学位期间成果

致谢

统计学证明