同种异体骨髓间充质干细胞输注治疗大鼠辐射损伤

摘要

背景与目的
　　 放射治疗是肿瘤治疗中的一项重要手段,随着肿瘤发病率的增高,放射治疗的应用相对以往明显增加,随之出现的放射性损伤也相应增多。自1895年伦琴发现X射线,以及铀、镭等相继发现,揭开了人类利用电离辐射的序幕。然而,电离辐射却是一把双刃剑,它也会对人体健康造成一定的危害。辐射损伤是由于辐射能作用于机体后引起体内一系列的变化,当损伤严重时可使组织器官发生不可逆的破坏甚至导致机体死亡。国内外学者对于辐射损伤的氧自由基学说较为肯定,氧自由基的产生和清除保持一个动态的平衡,辐射损伤可生成大量自由基,引发脂质发生氧化反应,导致细胞膜破坏和细胞死亡,继而引起体内抗氧化物质活力的变化,打破机体的氧化-抗氧化体系的平衡。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)是体内重要的自由基清除剂,在机体的氧化与抗氧化平衡中发挥重要的作用,能清除自由基,保护细胞膜免受氧化和脂质过氧化损伤。丙二醛(malondialdehyde,MDA)是自由基攻击生物膜引发脂质过氧化的产物,可与蛋白、核酸(DNA、RNA)和磷脂等含有氨基的物质交联,引起这些大分子化合物的分子交联。因此MDA水平可反映机体内脂质过氧化的程度,其在血液的水平可间接反映细胞损伤的程度。本实验研究观察指标之一就是间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)移植后能否改变大鼠体内氧自由基水平。肾脏、睾丸、肺脏、肝脏等机体脏器属于放射高敏感性器官,容易受到辐射损伤,出现器官功能障碍,影响机体代谢、解毒、分解等,最终导致生命危害。本研究模拟临床放射治疗的辐射模式建造损伤模型,并检测相应脏器的功能指标,探索辐射损伤后各脏器结构、功能的变化以及MSCs干预治疗的效果。
　　 实验方法
　　 第一部分 大鼠间充质干细胞的体外培养与鉴定
　　 实验在无菌条件下分离大鼠肱骨、股骨和胫骨,用PBS缓冲液冲出骨髓,离心后接种含10％胎牛血清(FBS)的L-DMEM培养基中,按2×106/cm2密度接种于培养瓶中,置于孵箱中培养。48h后半量换液,第五天全量换液,待细胞生长至80-90％融合时,0.25％胰酶消化传代。倒置显微镜观察细胞形态,流式细胞术进行细胞周期分析,用流式细胞仪检测细胞表面抗原CD34、CD45、CD29及CD44的表达,进行细胞鉴定,从而为本实验提供大量的同种异基因大鼠骨髓间充质干细胞。
　　 第二部分 MSCs治疗辐射损伤效果的研究
　　 选取15只雄性SD大鼠随机分为三组,即对照组、模型组和治疗组。模型组和治疗组大鼠一次性接受直线加速器产生的X线照射,6Gy/周,共3周,总剂量18Gy,对照组不接受照射。其中治疗组大鼠在接受照射24h后尾静脉注射间充质干细胞3×106/只,共三次；模型组和对照组大鼠同期尾静脉注射同等体积的生理盐水。常规饲养大鼠,待模型组大鼠处于濒死状态时,腹腔注射苯巴比妥钠注射液麻醉大鼠,提取大鼠血清应用全自动分析仪及酶标仪检测血清中肌酐(Creatinine,Cr)、尿素(Urea,UA)、丙氨酸氨基转移酶(Alanine aminotransferase,ALT)、天冬门氨酸氨基转移酶(Aspartate Aminotransferase,AST)、乳酸脱氢酶(Lactate Dehydrogenase,LDH)、碱性磷酸酶(Alkaline Phosphatase,ALP)及睾酮(Testosterone,T)的水平；采用硫代巴比妥酸和黄嘌呤氧化法分别检测血清和各个组织中MDA含量和SOD活性；制作各个组织常规石蜡切片,观察三组大鼠各个组织结构的差异,从功能学水平,生化水平及细胞形态学水平研究MSCs是否具有治疗辐射损伤的作用。
　　 统计学方法
　　 实验资料结果用均数±标准差((x)s)表示,显著性标准为P<0.05,采用SPSS13.0统计软件包进行统计分析。组间比较用单因素方差分析(One-WayANOVA)；重复测量数据用重复测量方差分析(Reperted measurementexperiment)；组间两两显著性比较方差齐采用LSD法,方差不齐用Dunnett T3。相关性采用偏相关分析(Partial correlation analysis)。
　　 结果
　　 第一部分 大鼠间充质干细胞的培养与鉴定
　　 ①本实验分离的骨髓间充质干细胞于48h后贴壁生长,全量换液后可见细胞呈星形、多边形和不规则形；10天左右时,细胞即可融合近80％。传代培养后细胞形态基本上趋于一致,光镜下见细胞呈梭形,核圆,位于细胞中央,胞质肥大,胞膜清晰；
　　 ②流式细胞术证明G0+G1期的细胞约占80％以上,说明MSCs在体外具有只增殖不分化的特点；
　　 ③经流式细胞仪检测,Cell Quest软件分析,结果显示第3代MSCs的特异性表面标志物:CD34-/CD45-/CD29+/CD44+,CD29+、阳性率为98.9％,CD44+、阳性率为93.5％,说明本实验培养的细胞为间充质干细胞。
　　 第二部分 MSCs移植治疗辐射损伤效果的研究
　　 ①观察大鼠的一般状态:对照组大鼠精神状态好,活动自如；模型组大鼠精神萎靡,反应迟钝,活动少,嗜睡,毛发变黄；治疗组大鼠精神状态一般,毛发微黄,反应较模型组灵敏。
　　 ②全自动生化分析仪检测血清中肌酐和尿素的含量,结果显示:对照组、模型组及治疗组血清中尿素含量分别为4.90±0.31、19.64±0.75、11.88±1.16mmol/ml；Levene检验方差不齐,F=5.956,P=0.016；采用Dunnett's T3法进行多重比较,P值均<0.05,差异具有统计学意义。肌酐含量分别为44.20±3.56、85.40±4.62、58.40±3.51μmol/ml,Levene检验方差齐,F=0.276,P=0.763；采用LSD法进行组间两两比较,P值均<0.05,差异具有统计学意义。
　　 ③全自动生化分析仪检测血清中ALT、AST、ALP及LDH的含量,结果显示:对照组、模型组及治疗组血清中ALT的含量分别为19.00±6.32、54.20±3.56、36.00±4.74IU/L;Levene检验方差齐,F=0.757,P=0.490；采用LSD法进行组间两两比较,P值均<0.05,差异具有统计学意义。AST的含量分别为48.00±10.93、187.80±37.09、89.80±13.37IU/L；Levene检验方差齐,F=2.486,P=0.125；采用LSD法进行组间两两比较,P值均<0.05,差异具有统计学意义。ALP的含量分别为5.40±3.44、342.60±53.87、163.40±23.87 IU/L；Levene检验方差不齐,F=7.135,P=0.009；采用Dunnett’s T3法进行多重比较,P值均<0.05,差异具有统计学意义。LDH的含量分别为133.40±34.27、768.20±27.99、407.60±63.82 IU/L；Levene检验方差齐,F=3.380,P=0.069；采用LSD法进行组间两两比较,P值均<0.05,差异具有统计学意义。
　　 ④酶标仪检测大鼠血清中睾酮(T)的水平,结果显示:对照组、模型组、治疗组分别为6.55±0.55 IU/L、0.76±0.52 IU/L、4.28±0.78 IU/L；Levene检验方差齐,F=0.277,P=0.763；采用LSD法进行组间两两比较,P值均<0.05,差异具有统计学意义；说明MSCs治疗组与模型组相比,能够升高雄性大鼠体内T的含量。
　　 ⑤采用硫代巴比妥酸和黄嘌呤氧化法分别检测血清SOD的活性及MDA含量,结果显示:对照组、模型组及治疗组血清SOD的活性分别为110.0959±5.4115U/ml,64.1013±3.6994 U/ml,84.2043±3.1574 U/ml；Levene检验方差齐,F=1.700,P=0.224；采用LSD法进行组间两两比较,P值均<0.05,差异具有统计学意义。MDA含量分别为7.8059±1.3564nmol/ml、50.9283±3.2640nmol/ml、21.6118±0.9332 nmol/ml,Levene检验方差齐,F=3.597,P=0.06；采用LSD法进行组间两两比较,P值均<0.05,差异具有统计学意义。
　　 ⑥病理形态学显示:模型组与对照组比较,脑、肝脏、肾脏、脾脏、睾丸的结构破坏明显；MSCs治疗组与模型组相比,各脏器的结构得到明显改善；
　　 结论
　　 1、本实验方法能有效地获得骨髓间充质干细胞,采用贴壁法培养的骨髓细胞经鉴定为间充质干细胞。
　　 2、本实验从功能学水平、形态学水平、生化水平检测,发现MSCs具有修复和改善大鼠脏器辐射损伤的效果,说明同种异体骨髓间充质干细胞输注具有治疗大鼠辐射损伤的作用。
　　 本研究的创新点:
　　 本研究从MSCs具有多向分化潜能的干细胞特征入手,研究骨髓间充质干细胞在辐射损伤动物体内调节、修复受损的脏器,能够从根本上解决损伤脏器修复的问题；
　　 本研究的价值:本实验从MSCs多向分化潜能着手,研究同种异体骨髓MSCs输注对大鼠辐射损伤脏器的影响,为治疗辐射损伤提供了有力的实验依据,同时为MSCs的生物细胞治疗打开另一个全新的思路。

目录

文摘

英文文摘

前言

参考文献

第一部分 大鼠间充质干细胞的体外培养与鉴定

摘要

Abstract

引言

1 实验动物及实验材料

2 实验方法

3 实验结果

4 讨论

小结

参考文献

第二部分 MSCs输注治疗大鼠辐射损伤效果的研究

摘要

Abstract

引言

1 实验动物及实验材料

2 实验方法

3 结果

4 讨论

小结

参考文献

中英文缩略词表

致谢

硕士就读期间参与的科研项目和发表的相关论文

统计学证明