氯化锂联合脐血干细胞及脊髓去细胞支架移植修复大鼠脊髓损伤的实验研究

摘要

脊髓损伤(spinal cord injuries,SCI)是现在交通、工矿事故、运动意外以及战伤中常见的损伤,伤者多为青壮年,损伤造成的截瘫不仅严重影响患者的身心健康,而且给家庭和社会造成巨大的经济、人力和精神负担。长期以来脊髓损伤的修复一直是困扰人类健康的难题,也是世界各国科学家们致力于研究的焦点,但目前缺少切实可行的有效治疗方法。脊髓损伤的治疗一直是神经科学研究的难点和热点,传统观点认为中枢神经系统损伤后,由于神经元自身再生能力差和外在微环境的抑制,损伤神经是不可再生的。1981年神经学家在基础研究中证实中枢神经损伤后的神经结构修复是可能的,掀起了各国学者对脊髓修复研究的又一次热潮。SCI后轴突再生障碍的因为相当复杂,其主要因为有:(1)对脊髓的直接损伤及继发炎症使脊髓内功能神经元大量坏死或凋亡且神经元再生困难；(2)脊髓损伤后暴露的髓鞘相关抑制分子、轴突生长抑制性蛋白的大量分泌和释放及继发形成的胶质瘢痕阻碍了轴突的生长和正确连接；(3)损伤造成局部细胞凋亡,致使细胞分泌的神经营养因子减少,破坏了神经元修复和支持轴突再生的有利微环境。目前SCI的修复研究主要集中在以下几个方面:(1)药物治疗:如传统的大剂量皮质类固醇激素(甲基强的松龙)的冲击治疗,可以有效的减轻脊髓的继发性炎症损伤,保护并防止残存的损伤神经元进一步凋亡。目前研究的氯化锂(LiCl)、免疫抑制剂FKS06等除了可以保护损伤神经元外,还可以有效的促进损伤轴突再生。(2)细胞移植:细胞移植是目前研究的热点,其原理是利用某些种子细胞可以分泌多种神经营养、黏附和趋化因子,营养并保护损伤神经元、诱导轴突再生及再髓鞘化来修复SCI。既往的研究已为SCI修复提供了较成熟的种子细胞,如:胚胎干细胞(ESCs)、雪旺氏细胞(SCs)、嗅鞘细胞(OECs)、神经干细胞(NSCs)、骨髓间充质干细胞(BMSCs)、脐血干细胞(UCBCs)等,大量研究证实细胞移植均能够在一定程度上促进脊髓神经功能的恢复。(3)组织移植:随着组织工程学的飞速发展,一种更先进的SCI修复理念逐步形成,即修复SCI必须包括组织水平上的重建,整合SCI治疗研究的各种有效策略,在诱导轴突定向再生的同时,减少局部胶质瘢痕形成。目前,应用于脊髓的组织工程支架主要有两种,一种为人工合成可降解高分子生物材料,如:聚乳酸、聚乙醇酸及其共聚物等,另一种为自体或异体组织移植,如异体胚胎脊髓组织、自体肌纤维支架、游离周围神经或带血管蒂的游离周围神经组织移植修复脊髓损伤,也取得了一定的修复效果。(4)改善脊髓损伤局部微环境:SCI后轴突再生困难的另一关键因素就是适宜轴突再生的微环境遭到破坏,各种不利于轴突再生的髓磷脂源性蛋白(myelin,MAG,Nogo-A,Omgp)轴突再生抑制分子大量分泌,而各种神经营养因子(BDNF、GDNF、NGF、NT3等)的缺乏及胶质瘢痕形成阻碍了轴突再生。(5)联合治疗:采取联合不同作用机制的治疗方法,更好的发挥协同作用来促进SCI后神经修复。本研究拟用氯化锂联合脐血干细胞及脊髓去细胞支架移植修复大鼠脊髓全横断损伤,观察该方法对SCI后神经再生和脊髓修复的影响,并探讨其促进脊髓修复的作用机制。
　　 目的
　　 1.探讨脐血间充质干细胞(MSCs)体外分离、纯化、扩增的方法与条件,以及向神经细胞定向诱导分化的可行性,为脐血干细胞移植治疗脊髓损伤提供理论依据。
　　 2.探讨氯化锂体外诱导人脐血间充质干细胞(MSCs)向神经细胞分化的可行性。
　　 3.制备脊髓去细胞支架,观测脊髓内基质骨架的结构特点。
　　 4.探索氯化锂联合脐血干细胞及脊髓去细胞支架移植对大鼠脊髓全横断损伤的效果及其机制。
　　 方法
　　 1.无菌条件下收集正常足月儿的脐带血,肝素抗凝,密度梯度离心法分离人脐血单个核细胞,贴壁法纯化,用含15％FBS的低糖DMEM培养基进行扩增培养,流式细胞仪检测表面抗原。20ng/ml bFGF诱导MSCs向神经细胞分化,免疫组化鉴定神经元特异性标志蛋白MAP-2。
　　 2.取3代的脐血MSCs分3组进行体外诱导,A组:用含15％FBS和20ng/mlbFGF的DMEM完全培养基预诱导24 h,3mol/LLicl的DMEM培养基继续诱导6d；B组:含3mol/L,Licl的DMEM培养基诱导7d；C组:含15％FBS的DMEM培养基正常培养7d。光镜下观察细胞形态,用免疫组化技术检测细胞NSE、MAP-2及GFAP的表达。
　　 3.取健康成年SD大鼠脊髓数段,每段长约2cm,手术显微镜去除脊髓表面的脂肪组织和硬脊膜,分为A、B、C三个组,每组取1个标本作为正常对照,其余段均行化学萃取。A、B、C三个组的萃取振荡频率分别为80r/min、120r/min和160r/min。将标本采用Triton X-100和脱氧胆酸钠进行萃取,蒸馏水漂洗后行切片HE染色和扫描电镜观察。萃取后的脊髓置于4℃无菌PBS溶液(0.01mol/L,pH7.4)中保存备用。
　　 4.首先经大鼠胸T9节段制备脊髓全横断损伤模型。120只成年雌性SD大鼠随机分为6组,每组20只:①A组为对照组:仅行T9平面脊髓全横断；②B组为Licl组:脊髓全横断+Licl(腹腔注射85mg/kg,1/日)；③C组为细胞移植组:脊髓全横断+UCB-SCs移植；④D组细胞支架联合移植组:脊髓全横断+支架复合hUCB-SCs移植；⑤E组为Lid+细胞移植组:脊髓全横断+hUCB-SCs移植+Licl;⑥F组为Licl+细胞支架联合移植组:脊髓全横断+支架复合hUCB-SCs移植+Licl。于术后1d、3d及每周的最后一天,应用BBB评分评价大鼠脊髓功能的恢复情况；8周后取材,通过HE染色及Brdu细胞核标记观察移植细胞的存活、迁移；通过免疫组化染色的方法,观察hUCB-SCs向神经细胞分化及表达神经纤维的情况:通过荧光金逆行追踪,观察脊髓神经纤维的再生与分布；综合全面评价治疗措施修复脊髓损伤的效果。
　　 结果
　　 1.采用密度梯度离心法成功从脐血中分离出脐血间充质干细胞,流式细胞仪检测显示细胞不表达或弱表达CD14、CD34和CD45等造血干细胞和内皮细胞标志,但显著表达神经细胞表面标志CD90和间充质干细胞表面标志CD29、CD105。经20ng/ml bFGF诱导14天后长梭形的MSCs胞体收缩,呈圆形、不规则多边形,细胞出现类似神经元形态。兔疫组化染色MAP-2呈弱阳性表达。
　　 2.A组与B组诱导3d后细胞即出现形态学上的改变,细胞变成不规则形,立体感增强,从胞体伸出突起。免疫组织化学和免疫荧光方法鉴定显示,诱导后的细胞能表达神经元特异性标志NSE和MAP-2,阳性表达率A组(分别为73.6±7.8％,75.5±8.5％)高于B组(分别为31.0±4.3％,33.5±5.0％)(P<0.05),而星形胶质细胞特异性标志GFAP阳性细胞较少,A、B、C三组阳性表达率分别为4.7±3.3％、5.1±4.6％、8.5±3.2％。
　　 3.采用化学萃取方法可以成功制备大鼠脊髓去细胞支架,其扫描电镜结果显示,采用120r/min的震荡频率萃取的脊髓去细胞支架内基质纤维结构保存较好,基质纤维走形与脊髓纵轴一致,呈波浪状平行排列,彼此之间有短横向的基质纤维相互连接成三维镂空的网状结构。
　　 4.术后8周C、D、E、F组可观察至Brdu标记的脐血干细胞在体内存活并在脊髓内迁移,其中D、F组细胞存活数量多于C、E组(P<0.05)。FITC荧光标记NF-200阳性神经纤维的表达,在A组和B组未见表达；D、F组阳性表达数高于C、E组(P<0.05),可见少量连续性神经纤维通过损伤区。荧光金逆行脊髓追踪显示E组和F组在脊髓损伤区头侧中有少量被荧光金标记的神经锥体细胞,而C组和D组偶见被荧光金标记的神经锥体细胞,对照组和单纯氯化锂组未见被荧光金标记的神经锥体细胞。后肢功能运动BBB评分除对照组和单纯氯化锂组间无统计学差异外,E组和F组的BBB评分较其他组提高(P<0.05),其中,F组好于E组,D组好于C组。
　　 结论
　　 1.脐血中可以分离并扩增MSCs;脐血MSCs经bFGF体外诱导可以向神经元样细胞分化,并部分表达神经元特异性标志MAP-2。
　　 2.Licl体外可诱导人脐血MSCs分化为神经元样细胞,结合生长因子bFGF预诱导可大大提高其诱导效果。
　　 3.采用化学萃取方法可以成功制备大鼠脊髓去细胞支架；脊髓去细胞支架保存有天然的脊髓内基质纤维骨架,可有效的引导神经细胞和神经纤维定向生长和迁移。
　　 4.氯化锂能促进人脐血间充质干细胞在损伤区的存活并向神经细胞分化,脊髓去细胞支架内天然的脊髓基质骨架能为脊髓两侧残端基质提供良好对接,阻止外源性瘢痕长入,引导神经细胞和神经轴突定向生长和迁移,氯化锂联合脐血干细胞与脊髓去细胞支架移植能够促进细胞移植修复大鼠脊髓损伤的效果。

目录

文摘

英文文摘

前言

第一章 人脐血间充质干细胞的分离、体外培养、纯化和鉴定

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

参考文献

第二章 氯化锂体外诱导人脐血间充质干细胞向神经细胞分化的试验研究

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

参考文献

第三章 机械振荡和化学萃取法制备脊髓去细胞支架

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

参考文献

第四章 氯化锂体联合脐血干细胞及脊髓去细胞支架移植修复大鼠脊髓损伤的实验研究

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

全文总结

参考文献

中英文缩略词

攻读学位期间成果

致谢

统计学证明