江门某医院儿童急性腹泻患者诺如病毒的检测与毒株型别分析

摘要

目的:
　　 1.研究江门地区某医院儿童病毒性腹泻患者中诺如病毒(norovirus,NoV)感染基因型别,探讨流行的优势毒株,
　　 2.疑似NoV重组株的重组鉴定及其重组区域的初步分析,探求可能的重组信息。
　　 方法:
　　 1.在江门妇幼保健医院儿科门诊部,收集两年5岁以下病毒性腹泻患儿粪便标本,每个月的前15天为标本收集日,连续收集24个月(2005年9月-2007年8月)。标本采集当日检测轮状病毒后电话通知检测结果,并调查有关问题。
　　 2.用胶体金法检测轮状病毒后,再对所有标本进行核酸提取、合成cDNA,用引物.JV12Y/JV13Ⅰ扩增NoV的RdRp区、用分型引物G Ⅰ SKF/G Ⅰ SKR.或COG2F/G Ⅱ SKR扩增Capsid的N/S区,PCR产物纯化回收、测序,应用BLAST将测序结果在GenBank上寻找与各株同源序列,应用Clustal W进行多序列对比分析和MEGA4.1构建遗传进化树,进行NoV基因型别分析,判断NoV流行优势株。
　　 3.对于疑似NoV重组株,采用引物JV12Y/G Ⅰ SKR或JV12Y/G Ⅱ SKR扩增包括NoV ORF1,2重叠区基因序列,应用BLAST将测序结果在GenBank上寻找与其同源序列,并利用SimPlot3.5.1软件进行基因重组鉴定,用BioEdit和DNAMAN对重组区的核苷酸序列和RNA的二级结构进行初步分析。
　　 结果:
　　 1.两年共收集了881份江门儿童腹泻患者标本,其中NoV检出率为13.1％(115/881)。随机对其中检出的67株NoV阳性标本进行测序分析,57株属于GⅡ.4型,6株属于G Ⅱ.3型,2株属于G Ⅱ.6型,2株为重组株。
　　 2.NoV/Jiangmen056/2006/china株由Lordsdal株的RdRp区和Mexico株的capsid区重组而成,而NoV/Jiangmen380/2006/china株由NLV/VannesL169/2000株的RdRp区和SaKaeo-53株的capsid区重组而成。
　　 3.NoV/Jiangmen056/2006/china株、NoV/Jiangmen380/2006/china株与其参考株的ORF1/2重叠区核苷酸序列和RNA二级结构分析,发现28个高度保守的核苷酸和相似的发卡样RNA二级结构。
　　 结论:
　　 1.江门地区儿童腹泻患者中NoV感染比较普遍,是重要的致泻病原体,同时存在不同基因型别的NoV感染,也存在基因重组毒株。67株测序NoV样本中57株属于GⅡ.4型,6株属于GⅡ.3型,2株属于GⅡ.6型,2株为重组基因型,其流行优势毒株为GⅡ.4型。
　　 2.NoV/Jiangmen056/2006/china和NoV/Jiangmen380/2006/china是两种不同型别NoV重组株,为我国南方地区首次发现,其中NoV/Jiangmen380/2006/china是国内一种新型G Ⅱ.b NoV重组株,其ORF1/2重叠区保守的核苷酸序列及形成发卡样的RNA二级结构可能为其重组发生提供条件。

目录

文摘

英文文摘

第一部分 前言

一.诺如病毒背景介绍

二.国内外NoV优势株鉴别概况及分析

三.国内外NoV重组株鉴别概况及分析

四.NoV重组位点信息

五.研究意义

第二部分 实验材料和方法

一.主要实验材料和仪器

二.研究对象

三.实验步骤与方法

第三部分 江门株NoV基因型别分析

一.结果

二.讨论

第四部分 NoV/Jiangmen/056/2006和NoV/Jiangmen/380/2006重组鉴定及分析

一.实验步骤与方法

二.结果

三.讨论

全文小结

参考文献

附录1 缩略语词汇表

附录2 儿童腹泻调查表

硕士期间论文发表情况

致谢

统计学合格证明