脑肿瘤干细胞RNA致敏树突状细胞治疗9L脑肿瘤的实验研究

摘要

神经胶质瘤是最常见的中枢神经系统恶性肿瘤,其占所有原发性脑肿瘤的35.26～60.96％(平均44.69％)。恶性胶质瘤呈浸润性生长,具有手术切除不彻底,预后差的特点,极大地威胁着患者的生命。尽管外科手术水平,放疗、化疗技术不断提高,但并没能显著改善脑胶质瘤患者的预后,平均生存期仅为14.6个月。传统观点认为,胶质瘤细胞均具有无限增殖能力,但近年来,研究发现,很多的肿瘤中仅有一小部分细胞具无限增殖、自我更新、多向分化潜能及致瘤性,这部分细胞被称为肿瘤干细胞(cancer stem cells,CSC),而其它大部分瘤细胞则无或仅具备短暂的增殖能力。到目前为止,人们已成功从造血系统恶性肿瘤、乳腺癌和脑肿瘤等肿瘤中分离出了各自的肿瘤干细胞。脑肿瘤研究者将脑肿瘤组织中的肿瘤干细胞称之为脑肿瘤干细胞(Brain tumor stem cell,BTSC)。
　　 胶质瘤具异质化的特性,即胶质瘤中的各种瘤细胞在侵袭能力,生长速度、分化程度、对激素的反应、对抗癌药物的敏感性等方面均有所不同。恶性胶质瘤经过手术、放疗、化疗等治疗后,绝大多数瘤细胞都被杀死,而其中胶质瘤干细胞多处于细胞周期的G0期(相对静止期),且高表达多种耐药基因和抗凋亡基因。因此脑肿瘤干细胞对传统放、化疗不敏感,更不易被杀灭,在治疗过程中,若胶质瘤干细胞残留,那么在一定条件下它将有可能复苏,从而增殖、分化,导致肿瘤的复发。因此,肿瘤干细胞是肿瘤的根源,脑肿瘤干细胞是脑肿瘤的“种子细胞”,脑胶质瘤的治疗应该靶向脑胶质瘤干细胞。
　　 中枢神经系统很长时间内被认为是免疫豁免区,现有证据表明,中枢神经系统的免疫豁免不是绝对的,脑组织仅是免疫原性低下的器官。在多种病理情况下,血脑屏障受到破坏而开放,淋巴细胞可以进入中枢神经系统发挥免疫作用。因此,免疫反应可以介入中枢神经系统疾病,这为中枢神经系统肿瘤的免疫治疗提供了理论基础。
　　 树突状细胞(Dendritic cells,DCs)是功能最强大的抗原呈递细胞,它具树突状结构,具有活跃地摄取、处理抗原的能力,并高表达主要组织相容性复合体MHCⅠ、Ⅱ类分子和CD80、CD86等共刺激分子,能有效地向T细胞呈递抗原、激发初次细胞免疫应答。目前用来“装载”DC的抗原有死亡的肿瘤细胞、细胞裂解物、凋亡体、纯化的蛋白质和抗原肽,质粒cDNA及核酸(包括肿瘤DNA及RNA)等。由于胶质瘤异质性的存在,使得胶质瘤特异性抗原的纯化分离困难。最适当的宿主抗肿瘤的T细胞反应需要一系列的抗原决定簇,而不是仅仅局限于某一个抗原决定簇。因此,给予全肿瘤细胞抗原或肿瘤总RNA等冲击致敏DC是简便而有效的方法。
　　 近年来不断有研究表明,利用编码肿瘤相关抗原的RNA或包含全部肿瘤信息的RNA转染DC,能诱导出肿瘤特异性的或针对多个抗原表位的T细胞反应。目前,将RNA作为树突状细胞致敏物,所制备的树突状细胞肿瘤疫苗已成功运用于结肠癌、直肠癌、前列腺癌、肾细胞癌、乳腺癌、肺癌及脑肿瘤等的实验研究中。且研究表明,以肿瘤细胞RNA致敏树突细胞所产生的抗肿瘤免疫反应明显强于其它抗原。
　　 与传统疫苗相比,核酸疫苗可激发机体全面的免疫应答,其表达的抗原肽接近天然构象,抗原性更强,可通过将编码不同抗原的基因联合构建使疫苗的作用靶点增多。将RNA作为树突状细胞的致敏源,构建RNA疫苗更具优势。首先,RNA可从少量细胞或肿瘤活检、冰冻切片组织中获得,并可经RT-PCR和体外转录大量扩增得到足够的量,使RNA疫苗可以应用于术后或肿瘤负荷很小的患者。其次,利用肿瘤细胞总RNA转染DCs,无需鉴定肿瘤抗原表位及患者人类白细胞抗原(human leukocyte antigen,HLA),可诱导出针对肿瘤细胞多靶位的多克隆免疫应答,从而能够有效地防止由于抗原变异而引起的免疫逃避；第三,RNA在哺乳动物细胞中的半衰期不足24小时,RNA疫苗只在宿主细胞的胞质中表达；而DNA疫苗需要进入细胞核后再进行转录,未整合的DNA可以在未分裂的细胞中持续发挥作用达数月之久,所以.RNA疫苗没有导致癌变的危险性；最后,利用差异筛选等方法获得肿瘤细胞特异性表达的肿瘤mRNA,使肿瘤组织mRNA富集,用这种差异筛选的肿瘤mRNA刺激DC,不仅可诱导产生特异性抗胶质瘤免疫反应,而且又可降低自身抗原刺激DC诱发的自身免疫性疾病的风险。研究表明,利用转染RNA的DC肿瘤疫苗对荷瘤小鼠进行治疗,无自身免疫反应发生。因此,转染RNA的DC肿瘤疫苗是一种制备简便、效果显著、应用安全的肿瘤疫苗。
　　 随着肿瘤干细胞研究的不断深入,不少研究者开始以肿瘤干细胞作为DC的抗原致敏物,制备DC肿瘤疫苗,发现利用该方法所诱导出的抗肿瘤免疫反应明显强于传统肿瘤抗原。因此,说明将肿瘤干细胞做为树突状细胞的抗原致敏物,可能诱导出了靶向性杀伤肿瘤干细胞的CTL反应,产生了更强的抗肿瘤免疫反应。
　　 因此,基于树突细胞具强大的抗原呈递能力,脑胶质瘤干细胞是脑胶质瘤发生、发展和复发的关键。本研究选用大鼠9L胶质肉瘤细胞系作为研究对象,首先,利用无血清悬浮培养法从9L细胞系中诱导培养出胶质瘤干细胞样细胞,并对其干细胞特性进行观测。然后,提取9L脑肿瘤干细胞及9L贴壁细胞总RNA,转染F344骨髓源性DCs,制备DC疫苗；最后,建立9L/F344大鼠颅内胶质瘤模型,对其进行DC疫苗治疗,观察脑胶质瘤干细胞RNA致敏DC的疗效。
　　 第一部分大鼠9L脑肿瘤干细胞的培养和鉴定
　　 目的:建立大鼠9L脑肿瘤干细胞的体外培养和扩增方法,并从细胞形态、特异性标志物的表达及其致瘤性进行观察。
　　 方法:选择大鼠9L胶质瘤细胞系,分别应用含血清培养基(DMEM/F12+10％FBS)和无血清培养基(DMEM/F12+20ng/mLbFGF+20ng/mLEGF)培养。通过无血清悬浮培养方法,从大鼠9L胶质瘤细胞系中培养获得呈悬浮生长的9L肿瘤球；对9L肿瘤球细胞的一般形态、免疫表型、多向分化能力进行观察。为对比9L贴壁细胞和9L肿瘤球细胞致瘤性的差异,将9L胶质瘤细胞及9L肿瘤球细胞分别注射入宿主近交系F344大鼠右侧尾状核,对肿瘤组织进行CD133和Nestin免疫组织化学检测,并对动物生存期进行观察。
　　 结果:大鼠9L胶质瘤细胞在含血清培养基中呈贴壁生长,长出突起,呈短梭形、长梭形、星形、长纤维形；9L胶质瘤细胞在无血清培养基中,则呈悬浮状态生长,形成悬浮肿瘤克隆球,这些肿瘤球经0.01％胰酶消化后,能传代至少1个月以上。经免疫组织化学染色及流式细胞仪检测,大部分贴壁9L细胞及9L肿瘤球细胞均表达CD133和Nestin。将9L肿瘤球转入含血清培养基中,进行诱导分化,能产生表达神经元(NSE)、星形胶质细胞(GFAP)和少突胶质细胞(Gale)的子代肿瘤细胞。将贴壁9L细胞及9L肿瘤球细胞接种入近交系F344大鼠颅内后14天,贴壁9L细胞与9L肿瘤球细胞所形成的肿瘤表型相似,经免疫组织化学染色发现,两者形成的肿瘤均呈CD133和Nestin阳性。9L肿瘤球细胞注射组所形成的肿瘤体积较大,更具侵袭性,其浸及周围正常脑组织的范围更广。注射贴壁9L细胞组大鼠的中位生存期为21天,而注射9L肿瘤球细胞组的中位生存期为15天,经Kaplan-Meier分析,发现荷9L肿瘤球细胞组的生存期明显短于注射贴壁9L细胞组(P<0.001)。
　　 结论:大鼠9L胶质瘤细胞系中存在具无限增殖、自我更新及多向分化潜能的肿瘤干细胞样细胞,利用含bFGF和EGF的无血清培养基可对大鼠9L胶质瘤细胞系中的肿瘤干细胞样细胞进行有效扩增。但CD133和Nestin不能作为9L肿瘤干细胞的特异性标志物,9L脑肿瘤干细胞仅是CD133阳性细胞中的一部分。
　　 第二部分 F344大鼠骨髓源性树突状细胞的培养和鉴定
　　 目的:建立近交系F344大鼠骨髓源性树突状细胞(DC)的分离和培养方法,并对其形态学、细胞表面标志物进行检测,为树突细胞的肿瘤免疫治疗提供细胞来源。
　　 方法:获取近交系F344大鼠骨髓细胞,联合应用粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和白细胞介素4(IL-4)细胞因子对其进行诱导培养,从培养第7天开始添加肿瘤坏死因子α促使其成熟。对诱导培养第7天和第10天的F344大鼠骨髓源性树突状细胞进行OX62、CD80和CD86表面标记物的检测。
　　 结果:利用GM-CSF和IL-4可以从近交系F344大鼠骨髓细胞中诱导培养出DC,培养第7天未成熟:DC的OX62、CD80和CD86表达率分别为OX6263.12％,CD8050.71％,CD8647.36％;培养第10天成熟DC的OX62、CD80和CD86表达率分别为OX6296.45％,CD8090.49％,CD8692.55％。每只200g雄性近交系F344大鼠可获得约5×106个树突状细胞。
　　 结论:通过含GM-CSF和IL-4的RPMI-1640对近交系F344雄性大鼠骨髓细胞进行诱导培养,可获得足量较高纯度的树突状细胞,为DC的肿瘤免疫治疗提供了细胞来源。
　　 第三部分脑肿瘤干细胞RNA转染树突细胞治疗9L颅内胶质瘤模型的实验研究
　　 目的:利用大鼠9L脑肿瘤干细胞总RNA致敏树突状细胞(DC),治疗9L/F344大鼠颅内胶质瘤模型,观察DC疫苗对脑胶质瘤的治疗作用,初步探讨免疫反应的机理,为DC疫苗的临床应用提供实验基础。
　　 方法:利用大鼠9L脑肿瘤干细胞样细胞的总RNA冲击致敏DC,制备DC肿瘤疫苗(DC-9LTS),通过皮下注射的方式,对9L/F344大鼠颅内胶质瘤模型进行免疫治疗,观察荷瘤大鼠生存期,并与PBS组、单纯DC组和运用贴壁9L胶质瘤细胞总RNA致敏的DC组(DC-9L)进行比较,同时检测血清IFN-γ的浓度,对各治疗组肿瘤组织CD4、CD8淋巴细胞浸润情况进行免疫组织化学染色。
　　 结果:经生存周期分析发现:各实验组大鼠的中位生存期分别为:PBS组21天,DC组为21天,DC-9L组为31天,DC-9LTS组为36天。DC-9LTS组大鼠的中位生存期与其余各组比较,有显著性差异(P<0.01)。DC-9L组与DC组、PBS组之间比较,仍有显著性差异(P<0.01)。而DC组与PBS组之间无显著性差异(x2=0.071,P=0.789)。
　　 实验动物外周血IFN-γ检测结果:颅内接种大鼠9L胶质瘤细胞后第21天,各治疗组大鼠外周血IFN-γ浓度分别为:PBS组95.15±6.68pg/ml,DC组96.43±4.06pg/ml,DC-9L组132.64±1.77 pg/ml,DC-9LTS组157.08±7.25 pg/ml,control组为99.00±7.74 pg/ml。经统计学分析,DC-9LTS组的IFN-γ浓度显著高于其余各组(P<0.05)
　　 实验动物脑组织中CD4+、CD8+表达的检测结果:免疫组化染色观察肿瘤组织及瘤周CD4、CD8淋巴细胞浸润情况,结果发现DC-9LTS治疗组中,大鼠肿瘤组织内部及瘤周组织均有大量CD8淋巴细胞浸润,距离肿瘤组织较远的正常组织也发现有少量的CD8淋巴细胞浸润。DC-9L组中,在肿瘤组织内部及瘤周也可见CD8淋巴细胞浸润,但在这两组中,均未见CD4淋巴细胞的表达。DC-9LTS组CD8的平均光密度值(IOD)值明显高于DC-9L组(P<0.001)。而在DC组和PBS组中,肿瘤组织中未见CD4或CD8淋巴细胞浸润。
　　 结论:利用大鼠9L脑肿瘤干细胞样细胞总RNA体外致敏树突状细胞,制备树突状细胞疫苗,回输9L/F344大鼠颅内胶质瘤模型,能明显延长荷瘤大鼠生存期,为靶向性杀伤脑肿瘤干细胞的胶质瘤免疫治疗提供了实验基础及理论依据。