良性前列腺增生患者膀胱黏膜M受体亚型的测定及其意义

摘要

研究背景和目的：
　　 良性前列腺增生(Benign Prostatic Hyperplasia,BPH)是中老年男性的常见病、多发病,50岁男性的患病率在40％,且患病率随着年龄增长而增加,到80岁时患病率达到80％以上。随着我国人民生活水平的提高和平均寿命的延长,中国男性BPH患者会不断增加。
　　 BPH所导致的下尿路症状群(lower urinary tract symptoms,LUTS)是临床上BPH患者就诊的最主要原因。LUTS包括储尿期症状(尿频、尿急、夜尿增多、急迫性尿失禁)、排尿期症状以及排尿后症状。BPH储尿期尿频、尿急、急迫性尿失禁及夜尿增多等膀胱过度活动症(Overactive Bladder,OAB)症状发生率很高,严重影响患者的生活质量。根据国际尿控协会(InternationalContinence Society,ICS)的定义,OAB是以尿急症为核心症状的临床症侯群,伴有或不伴有急迫性尿失禁,常伴有日间尿频和夜尿症,且未能证实有尿路感染、代谢异常或其他病因。在欧美,OAB的患病率超过了哮喘、心绞痛和糖尿病等常见慢性病。而且,其对人们的生活质量造成严重的负面影响。据统计,英国有约1/5的人患有OAB;一组欧洲数据显示,男性OAB患病率为10.8％,女性为12.8％,美国男性中OAB患病率约为16％,女性为16.9％。我国北京地区18岁以上成年女性OAB的患病率为4.7％。目前,中国尚无全国性OAB流行病学方面的数据,但根据中国不同地区OAB的患病率估算,在中国约1亿人深受OAB困扰。在下尿路症状中,OAB症状对患者的日常生活影响最大:近50％患者诉OAB症状明显影响日常生活；急迫性尿失禁使患者更易因跌倒而骨折；患者社会活动时间减少、更孤僻、更易患抑郁症；夜尿症扰乱睡眠,影响患者心身健康。总之,OAB症状严重影响患者的生活质量,被公认为LUTS中最令人烦恼的症状。
　　 多数BPH患者都有OAB症状,Bates等报道50％～75％的老年男性BPH患者有OAB症状。BPH是一个组织病理学的定义,传统上认为BPH患者出现OAB症状的主要原因是BPH引起膀胱出口梗阻(Bladder Outlet Obstruction,BOO),而忽略了膀胱本身的问题。但是在一些没有BOO或可疑BOO的良性前列腺肥大的患者也存在不同程度的OAB症状,而一部分BPH患者即使切除前列腺解除BOO,术后OAB症状改善仍然不明显。Ameda等的研究表明约50％～75％的尿动力学结果提示BOO的BPH患者有OAB症状,而约46％～66％的尿动力学结果提示存在BOO的BPH患者有逼尿肌过度活动(Detrusor Overactive,DO),存在OAB和BOO的BPH患者,手术解除梗阻后DO好转。Kageyama等报道BOO合并DO的BPH患者,经尿道切除前列腺解除梗阻后,75％的患者的尿动力学DO消失。很多其他学者研究表明对BPH患者行手术治疗解除梗阻后,患者的排尿期症状明显改善,但仍有约1/3的患者OAB症状无法改善。
　　 BPH患者OAB症状发生的机制仍未阐明,被认为与DO有关。根据ICS的定义,DO是在尿动力学检查时观察到的在膀胱充盈过程中自发的或诱发的逼尿肌不自主收缩。BPH所致的尿频、尿急、夜尿增多、急迫性尿失禁等OAB症状与DO既有联系,又有差别。从ICS的定义中我们也可以看出OAB和DO并非直接关联,因为OAB是患者日常生活中出现的症状,而DO是在人工环境下行尿动力学检查时的纯功能性诊断,尽管如此,DO被认为是导致OAB症状的重要原因。有好些研究证实了DO与OAB症状之间有明显关联,比如Coolsaet等报道DO时逼尿肌收缩的速度和发生尿急的机会及程度相关；Shahab等报道BPH患者DO与夜尿症的严重程度有明显关联,并认为DO的幅度和持续时间影响OAB症状的严重程度；Wadie等报道DO影响BPH患者症状评分和生活质量评分；Hyman等报道DO与患者的急迫性尿失禁症状有明显的关系；Hashim等报道大多数OAB患者经尿动力学检查证实有DO,而绝大多数有DO的患者会表现出OAB症状；还有一些研究报道OAB症状与90％以上的患者的DO有关系。
　　 M受体拮抗剂是公认的治疗OAB症状有效的药物,对于M受体拮抗剂治疗OAB症状的机理,传统理论认为,M受体拮抗剂阻断膀胱逼尿肌上突触后(传出神经)M受体,进而抑制由副交感神经末梢释放的神经递质乙酰胆碱(Ach)所诱导的逼尿肌收缩。但是,OAB症状是储尿期出现的,而该理论是指抗胆碱药阻断排尿期由副交感神经末梢释放的Ach所引起的排尿期逼尿肌收缩。而且临床上也发现,治疗剂量的M受体拮抗剂能改善OAB患者的尿急症状和增加膀胱容量,未有证据说明它引起排尿困难或尿潴留。另外动物及人的研究表明在膀胱内灌注M受体拮抗剂明显改善DO/OAB症状。这说明,M受体拮抗剂治疗OAB症状的机理可能与抑制膀胱感觉通路(传入神经)有关,即与阻断膀胱黏膜M受体有关。
　　 以往膀胱黏膜被认为只起屏障作用,但越来越多的证据证明它还积极参与膀胱的感觉功能。近来证据也表明M受体机制也与膀胱黏膜感觉功能有关。膀胱黏膜有高密度的M受体,且在膀胱被牵张时黏膜会释放Ach。激动膀胱黏膜的M受体能释放一些物质,如ATP、NO、Ach,这些物质能调节传入神经活动。Yoshida等报道离体的人膀胱组织有Ach释放,这种Ach释放是非神经源性的,而带有膀胱黏膜的组织条所释放的Ach明显比没有带膀胱黏膜的组织条所释放的Ach多,因此膀胱组织条所释放的Ach至少部分来自于黏膜。Kim等报道膀胱内灌注M受体激动剂能够在储尿期产生DO,而储尿期所产生的DO也可被膀胱内灌注的M受体拮抗剂所抑制,得出结论认为M受体拮抗剂能够有效治疗OAB是因为不仅抑制了M受体介导的逼尿肌收缩,而且阻滞了膀胱传入通路上的M受体,据此推测膀胱黏膜M受体在DO/OAB症状中起着重要的作用。因此,膀胱黏膜M受体与DO/OAB症状关系密切,膀胱黏膜亦被认为是M受体拮抗剂治疗DO/OAB症状的作用靶点之一。
　　 M受体有M1-M5五种亚型,人类膀胱黏膜表达所有的M受体亚型mRNA,表达强度依次为:M2R>M3R=M5R>M4R=M1R,免疫荧光发现M1R主要位于基底细胞,几乎所有的M2R位于伞状细胞,M3R、M4R为均匀分布,M5R则自上皮腔面到基底部逐渐减少。病理状态下人的膀胱黏膜M受体亚型表达的报道仍较少,且结果存在矛盾之处。Mukerji等对12例特发性逼尿肌过度活动(IDO)患者采用PUF问卷调查表行尿急、尿频症状评分后,在膀胱镜下活检,标本采用M2、M3抗体免疫染色,发现M2、M3受体在上皮、神经纤维、逼尿肌层中有表达,与对照组比较,IDO患者上皮下成纤维肌细胞样细胞M2、M3表达上调,且与尿急、尿频症状评分相关,上皮及逼尿肌M2、M3受体表达无变化。Mansfield等观察了20例IDO女性患者膀胱黏膜M2、M3表达情况,发现黏膜中M2表达无变化、M3表达下调。Datta等使用免疫组化方法发现DO患者黏膜下M1、M3受体表达下调,且与尿急次数和24小时排尿次数负相关；膀胱上皮M1、M3表达下调。上述有关DO/IDO患者膀胱黏膜M受体检测的结果存在着明显的矛盾,且都有一个共同特点:那就是均来源于DO患者,而BPH及OAB患者的膀胱黏膜M受体亚型的检测未见报道。
　　 综上所述,BPH患者OAB症状发生率很高,严重影响患者的生活质量,但其发生机制仍未阐明,对于BPH患者膀胱黏膜中M受体的研究未见报道。膀胱黏膜的M受体可能在BPH患者DO/OAB症状的发生机制中起着重要的作用。本研究检测BPH患者有或无DO的膀胱黏膜M受体亚型的表达变化,评估其与临床症状、生活质量的关系,这将有助于进一步探讨BPH患者DO/OAB症状的病理机制及M受体拮抗剂的作用机理,以指导和帮助临床治疗BPH患者的OAB症状。
　　 材料和方法:
　　 膀胱黏膜组织标本均来自广州市第一人民医院的患者,收集时间为2010年6月～2011年2月。按照如下的患者入选及排除标准对患者进行筛选。
　　 BPH组的入选标准:①男性患者,年龄≥50岁；②患者主观上存在有下尿路症状(即尿频、尿急、急迫性尿失禁、夜尿、排尿困难等)；③经直肠超声前列腺体积增大(≥20ml)；④自由尿流率<15ml/s；⑤签署知情同意书。
　　 BPH组的排除标准:①有尿路感染的患者；②合并膀胱结石的患者；③合并膀胱肿瘤的患者；④已经诊断或高度怀疑为前列腺癌的患者；⑤糖尿病患者；⑥神经原性病变患者；⑦2月内服用影响膀胱功能的药物的患者；⑧拒绝参加本研究者。
　　 对照组的入选标准:①男性患者,年龄≥50岁；②患者主观上无下尿路症状(即尿频、尿急、急迫性尿失禁、夜尿、排尿困难等)的血尿、膀胱肿瘤、肾盂肿瘤、输尿管肿瘤或上尿路结石患者,需要做膀胱镜检查或手术切除膀胱者；③自由尿流率>15ml/s；④签署知情同意书。
　　 对照组的排除标准:①有OAB症状或梗阻症状的患者；②有尿路感染的患者；③糖尿病患者；④膀胱结石患者；⑤神经原性病变的患者；⑥前列腺增生症患者；⑦尿动力学检查证实有膀胱出口梗阻的患者；⑧拒绝参加本实验研究者。
　　 收集患者的一般人口学资料、病史采集、体格检查、尿液分析、肾功能检查、国际前列腺症状总评分(IPSS)、IPSS问题2-尿频评分、IPSS问题4-尿急症评分、IPSS问题7-夜尿症评分、生活质量评分(QOL)、自由尿流率、B超测剩余尿、经直肠B超测前列腺体积、尿动力学(膀胱压力-容积测定和压力-流率测定)检查。
　　 严格按照上述标准筛选,共有26例患者入选。其中6例膀胱肿瘤、血尿及输尿管结石患者做为对照组；20例BPH患者又根据尿动力学检查中是否有DO分成BPH有DO组及BPH无DO组,BPH有DO组有9例患者,BPH无DO组有11例患者。
　　 所有组织标本均通过膀胱镜活检或膀胱开放手术获得,取材部位为膀胱左侧输尿管开口头侧2cm处,获得标本后,放入组织冻存管,迅速投入液氮中,在冰上显微镜下去除逼尿肌成分,转移至-80度的冰箱中直至使用。进行实时定量PCR分析前,所有病理组织标本都经病理切片,HE染色后诊断确认。
　　 运用实时定量PCR分析膀胱黏膜中M1～M5受体的表达:(1)组织总RNA的制备。(2)应用Trizol试剂。(3)使用仪器为荧光定量PCR仪器(ABI7900,美国ABI公司)。(4)RNA纯度及完整性鉴定。(5)逆转录反应(RT)获得cDNA片段。(6)荧光定量PCR引物设计。设计引物之前,登录http://www.ncbi.nlm.nih.gov在Genbank中查寻CHRM1、CHRM2、CHRM3、CHRM4、CHRM5和GAPDH基因mRNA的序列(登录号依次为:NM_000738.2、NM_000739.2、NM_000740.2、NM_000741.2、NM_012125.3和NM_002046),以获得的序列为基础,应用引物设计软件DNA Club设计出通过荧光定量扩增CHRM1、CHRM2、CHRM3、CHRM4、CHRM5和GAPDH基因的引物。利用内参照葡萄糖6磷酸脱氢酶(GAPDH)基因的引物,在检测M1、M2、M3、M4和M5受体基因表达的同时对每个样品中GAPDH基因进行检测,以校正不同样品之间因RNA总量、质量及逆转录反应效率差异所致的目的基因的表达差异。所有引物由Invitrogen公司合成。(7)荧光定量PCR反应。(8)绘制荧光定量PCR标注曲线。(9)运用相对定量方法对数据进行处理。
　　 统计学处理:
　　 使用SPSS16.0软件进行数据分析。年龄分布采用方差分析方法,检验是否存在差异。另根据相关文献,M1～M5的mRNA相对拷贝数值应用中位数和四分位间距表示,即采用非参数检验方法。BPH有DO组、BPH无DO组与对照组M受体亚型等采用完全随机设计的多个样本间的秩和检验,即Kruskal—Wallis检验,如果P<0.05,则采用Mann—Whitney U检验进行多重比较,应用Bonferroni校正；M受体表达变化与IPSS总评分、IPSS中问题2(尿频)、问题4(尿急症)、问题7(夜尿症)等OAB症状相关性采用Spearman等级相关分析。
　　 结果:
　　 1、本研究共有26例患者入选。其中对照组6例,年龄(61.5±12.9)岁；BPH有DO组9例,年龄(73.2±7.7)岁；BPH无DO组11例,年龄(69.7±10.5)岁。组间年龄差异比较没有统计学意义(F=2.412,P=0.112)。
　　 2、对照组膀胱黏膜M受体mRNA标化拷贝数的中位数位置分布差异由大到小依次为:M3>M5>M4>M1>M2；BPH有DO组膀胱黏膜M受体mRNA标化拷贝数的中位数位置分布差异由大到小依次为:M4>M3>M5>M1>M2:BPH无DO组膀胱黏膜M受体mRNA标化拷贝数的中位数位置分布差异由大到小依次为:M4>M3>M5>M1>M2。
　　 3、BPH有DO组、BPH无DO组与对照组各组间M1～M5受体mRNA标化拷贝数比较,M1(H=1.580,P=0.454),M2(H=2.216,P=0.330),M3(H=0.890,P=0.641),M4(H=0.449,P=0.799),M5(H=0.022,P=0.989),各组间不存在统计学差异。
　　 4、BPH有DO组和BPH无DO组膀胱黏膜M1～M5受体与OAB症状(IPSS总评分,IPSS问题2-尿频、IPSS问题4-尿急症、IPSS问题7-夜尿症)及生活质量(QOL)评分的相关性分析。BPH有DO组膀胱黏膜M5受体与IPSS问题4-尿急症存在相关性(rs=-0.688,P=0.040),其余均不存在相关性。BPH无DO组膀胱黏膜M4受体与IPSS问题7-夜尿症存在相关性(rs=-0.608,P=0.047),其余均不存在相关性。
　　 结论:
　　 1、BPH患者膀胱黏膜表达M1～M5受体mRNA。
　　 2、BPH有DO及BPH无DO的患者膀胱黏膜M受体亚型mRNA拷贝数所占比例(排序)与对照组相比有差异,膀胱黏膜M受体在BPH合并OAB症状患者的发病机制中可能起着一定的作用。
　　 3、BPH有DO组、BPH无DO组与对照组各组间M1～M5受体mRNA标化拷贝数比较无统计学差异,DO对膀胱黏膜中的M受体亚型可能无明显影响。
　　 4、BPH有DO组膀胱黏膜M5受体与IPSS问题4-尿急症存在相关性；BPH无DO组膀胱黏膜M4受体与IPSS问题7-夜尿症存在相关性。
　　 本研究创新之处:
　　 传统观点认为,一线用药毒蕈碱胆碱能受体(M受体)拮抗剂治疗OAB症状是通过阻滞传出通路上的逼尿肌M受体,从而减少逼尿肌的收缩。然而治疗剂量的M受体拮抗剂对逼尿肌收缩没有明显的影响,提示M受体拮抗剂可能通过抑制膀胱感觉(传入神经)来治疗OAB症状,膀胱黏膜M受体表达的变化在BPH患者发生OAB症状中可能起着关键的作用。迄今为止,对于BPH患者膀胱黏膜中M受体亚型的检测及其临床意义未见报道。
　　 本项目的特色与创新之处是首次检测BPH患者膀胱黏膜M受体亚型的表达,评估其与临床症状、生活质量的关系,这将有助于进一步探讨DO/OAB症状的病理机制及M受体拮抗剂的作用机理,以指导和帮助临床治疗BPH患者的OAB症状。