ALDH1可作为鼻咽癌干细胞功能性标记物和临床预后的指标

摘要

研究背景与目的：
　　 干细胞(stem cells,SC)是一类具有自我复制能力(self-renewaling)的多潜能细胞,在一定条件下,它可以分化成多种功能细胞。根据干细胞所处的发育阶段把干细胞分为胚胎干细胞(embryonic stem cells)和成体干细胞(progenitor somaticstem cells)。胚胎干细胞即全能干细胞,能分化成机体的所有细胞。成体干细胞(如血液干细胞、间充质干细胞等)具有定向的分化功能和不对称分裂的特性,一个子代细胞和母代完全一样,另一个显示组织分化的特点。干细胞因此获得了自我更新、增殖及分化能力。
　　 随着对干细胞基础理论研究与应用的不断深入,人们设想肿瘤组织中可能存在一种极小量的肿瘤细胞,这类细胞具有无限增殖、自我更新和多向分化潜能,是肿瘤发生、增殖、转移和复发的根源,而其他的大多数肿瘤细胞并不具有这种能力；这一小部分细胞叫做肿瘤干细胞或肿瘤起始细胞(cancer stem cell、CSC,tumor initial cells、TIC)。最先证明存在的是白血病干细胞。在人急性髓性白血病(AML)患者中分离CD34+/CD38-表型的ALM细胞,将这类细胞接种于非肥胖型糖尿病/严重免疫缺血(non-diabetic/severe combined immunodeficiency,NOD/SCID)小鼠,可以产生类似人类的白血病,而CD34-/CD38+表型的白血病细胞却不易形成肿瘤。近些年来,越来越多的实体瘤肿瘤干细胞的存在被得到证实。AI-Hajj等证明乳腺癌Lin-ESA+CD44+CD24-/low细胞比Lin-ESA-CD44+CD24-/low细胞在NOD/SCID小鼠体内的成瘤能力更强。Singh等发现仅用100个CD133+脑肿瘤细胞接种于NOD/SCID小鼠就可以形成肿瘤,且这些肿瘤细胞的表型及分化程度与原发肿瘤相似,而接种于(5-10)×104个CD133-脑肿瘤细胞的NOD/SCID小鼠只是在注射部位形成一条胶质瘢痕。在其它实体肿瘤中如,黑色素瘤、肺癌、前列腺癌、卵巢癌、头颈部癌、大肠癌中也发现肿瘤干细胞。
　　 正常干细胞和肿瘤干细胞均是非常稀少的一个亚群,这给相关研究工作带来很大困难,如何分离和富集干细胞,是人们在一直关注的焦点。
　　 关于鼻咽癌干细胞的研究已有一些报告,Zhang等利用Brdu标记滞留细胞证实鼻咽黏膜基底部有散在干细胞同时也发现了散在标记滞留细胞。BrdU标记的鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma,NPC)细胞株5-8F接种到裸鼠皮下,8周后也可发现散在标记滞留细胞。Wang等利用Hoechst33342染料在鼻咽癌细胞株CNE2中分离出类似干细胞的侧群细胞,且认为CK19是鼻咽癌干细胞标志物。到目前为止,鼻咽癌干细胞还没有确切的标记物。虽然SP细胞可以富集鼻咽癌干细胞,但是有明显局限性。所以寻找鼻咽癌干细胞确切的标记物对研究鼻咽癌干细胞具有重要意义。
　　 乙醛脱氢酶1(aldehyde dehydrogenase1,ALDH1,ALDH1A1或RALDH1)是乙醛脱氢酶(ALDH)家族之一,是催化细胞内乙醛氧化为乙酸的细胞溶质酶。广泛在正常组织的发育和内环境稳定中表达,也表达在免疫细胞中。人类的ALDH1基因表达存在于细胞质中,其基因克隆和定位在9q21染色体,由53×103个碱基对构成,包含13个外显子,共编码501个氨基酸序列,无重复序列,N’端为蛋氨酸M(Met),具有一个谷氨酸(Glu)和一个半胱氨酸(Cys)激活位点,其基因启动区包含一个ATA盒和一个CCAAT盒,分别位于转录起始部位上游的32 bp和74 bp处。最近学者们发现ALDH1可作为肿瘤干细胞的标记物。最先在造血细胞中发现ALDH1可作为肿瘤干细胞的标记物,在实体瘤中,2007年Ginestier等首次利用ALDH1为标记物在乳腺癌实体组织中发现了乳腺癌干细胞。ALDH1+乳腺癌细胞只占乳腺癌细胞总数的5％,但具有自我更新、少数细胞致瘤、多向分化的潜能。他们用ALDH1+细胞进行肿瘤形成实验,只用500个ALDH1+细胞就能形成肿瘤,而即使用50000个ALDH1-细胞也不会形成肿瘤,说明ALDH1+细胞具有很高的致瘤能力。证明ALDH1是乳腺癌干细胞的标记物之一,并且还发现ALDH1也可作为乳腺癌临床预后指标。随后研究证明,ALDH1也可作为头颈部鳞状细胞癌、肺癌、前列腺癌、胰腺癌、眼癌、结直肠等实体瘤肿瘤干细胞的标记物。
　　 ALDH1在鼻咽癌中的研究在国内外还没见报道,本实验主要研究ALDH1的体内外生物学功能以及与鼻咽癌患者临床预后的关系。
　　 研究内容与方法：
　　 1.鼻咽癌5-8F细胞株中ALDH1+细胞的体内外生物学功能
　　 1)ALDEFLUOR试剂分选5-8F细胞株中ALDH1+细胞和ALDH1-细胞
　　 2)通过平板克隆形成实验、MTT生长曲线法,比较ALDH1+细胞和ALDH1-细胞体外的自我更新与自我增殖能力。
　　 3)Transwell实验分析ALDH1+细胞和ALDH1-细胞的转移能力。
　　 4)肿瘤球形成实验
　　 培养基配方:无血清培养基DMEM-F12+EGF+bFGF+B27,ALDH1+细胞和ALDH1-细胞和未分选5-8F细胞以1000/ml的密度进行培养,适时观察Sphere形成数量和大小。
　　 5)肿瘤球PKH26染色
　　 6)免疫荧光检测ALDH1在肿瘤球中表达
　　 7)体内成瘤实验
　　 5-8F细胞处于对数生长期时,胰酶消化、分选ALDH1+细胞和ALDH1-细胞,以500个、5000个、10000个、1×105个细胞分别注入SCID双侧腋下,观察成瘤情况。6周后,取出瘤块,固定、石蜡包埋并切片,HE染色,镜下观察结果。
　　 8)荧光定量PCR检测OCT4、BMI1、SOX2、KLF-4基因在ALDH1+细胞和ALDH1-细胞的mRNA表达水平
　　 2.ALDH1+细胞与侧群(SP)细胞关系的分析
　　 1)流式细胞仪分选SP细胞和非SP细胞
　　 2)免疫荧光检测ALDH1在SP细胞和非SP细胞表达
　　 3)流式细胞仪分选5-8F细胞株中ALDH1+细胞和ALDH1-细胞
　　 4)免疫荧光检测ABCG2在ALDH1+细胞和ALDH1-细胞的表达
　　 5)荧光定量PCR检测ALDH1在SP细胞和非SP细胞及ABCG2在ALDH1+细胞和ALDH1-细胞的表达
　　 3.ALDH1与鼻咽癌患者临床预后分析
　　 免疫组化检测ALDH1在122例鼻咽癌组织中的表达,用Kaplan-Meier法ALDH1的表达与鼻咽癌患者临床预后的关系,同时COX回归分析影响鼻咽癌患者临床预后的风险因子。
　　 4.ALDH1与上皮细胞一间充质细胞转化(EMT)关系的分析
　　 1)免疫组织化学检测E-cadherin、vimentin在鼻咽癌组织中的表达,spearman秩相关分析ALDH1与E-cadherin、vimentin的关系。
　　 2)流式细胞仪分选5-8F细胞株中ALDH1+细胞和ALDH1-细胞
　　 3)荧光定量PCR检测在E-cadherin、vimentin在ALDH1+细胞和ALDH1-细胞的表达
　　 4)免疫荧光检测E-cadherin、vimentin在ALDH1+细胞和ALDH1-细胞的表达
　　 结果：
　　 1.ALDH1的体内外生物学功能
　　 1)ALDH1+细胞占5-8F细胞的1.94％±0.69％
　　 2)MTT生长曲线结果提示:
　　 与ALDH1-细胞相比,ALDH1+细胞的增殖能力显著增强,两者具有差异具有统计学意义(F=154.333,P=0.000)。
　　 3)平板克隆形成实验结果提示:
　　 ALDH1+细胞体外培养其克隆形成率(53.500±2.784)％显著多于ALDH1-细胞(27.667±2.843)％,两者差异具有统计学意义(t=11.245,P=0.000)。与ALDH1-细胞相比,ALDH1+细胞体外自我更新,增殖能力更强。
　　 4)体外迁移能力
　　 Transwell迁移实验:细胞培养16h后,ALDH1+细胞穿过聚碳酸酯膜的细胞数(94.000±9.615)显著多于ALDH1-细胞(19.200±5.263),两者差异具有统计学意义(t=15.826,P=0.000)。
　　 5)形成肿瘤球的能力
　　 ALDH1+细胞形成肿瘤球的能力显著高于ALDH1-细胞和未分选的5-8F细胞(P=0.000),而未分选的5-8F细胞高于ALDH1-细胞(p=0.044),这说明ALDH1+细胞具有更强的自我更新,增殖能力。
　　 6)肿瘤球PKH26染色
　　 结果显示,部分肿瘤球细胞被PKH26染上色,说明肿瘤球中部分细胞是肿瘤干细胞。
　　 7)免疫荧光检测ALDH1在肿瘤球中表达
　　 结果显示,ALDH1在肿瘤球中普遍表达。
　　 8)SCID鼠体内成瘤实验
　　 注射细胞总数分别为1×105,1×104,5000,500个ALDH1+细胞和ALDH1-细胞观察6周,只要104个ALDH1+细胞就能形成肿瘤。而ALDH1-注射细胞数目1×105,观察6周均未见瘤体形成。提示ALDH1+细胞较ALDH1-细胞有更强大的致瘤能力。
　　 9)荧光定量PCR检测ALDH1+细胞、ALDH1-细胞表达干细胞相关基因,结果显示,OCT4(t=9.305,P=0.001),BMI1(t=7.224,P=0.002),KLF4(t=8.737,P=0.001),SOX2(t=10.309,P=0.000)在ALDH1+细胞中表达均高于ALDH1-细胞,差异具有统计学意义。
　　 2.分析ALDH1与SP细胞的关系
　　 1)荧光定量PCR检测ALDH1在SP中的表达显著高NSP细胞(t=8.925,P=0.001),同样,ABCG2在ALDH1+细胞中的表达显著高于ALDH1-细胞(t=11.044,P=0.000)。
　　 2)免疫荧光的结果显示,ALDH1在SP中高表达而在NSP细胞低表达,同样,ABCG2在ALDH1+细胞中高表达而在ALDH1-细胞低表达。
　　 3.ALDH1可作为鼻咽癌临床预后的风险因子
　　 免疫组织化学方法检测ALDH1在122例鼻咽癌组织中的表达,结果显示,ALDH1在鼻咽癌细胞中低表达,但在癌巢边缘和间质中,尤其是梭形细胞呈强阳性。通过Kaplan-Meier法分析了ALDH1的表达与鼻咽癌患者生存预后的关系,ALDH1的表达越高,中位生存时间越短;相反,表达越低,中位生存时间越长,提示ALDH1跟肿瘤的侵袭转移由密切关系。COX回归分析显示,ALDH1是影响鼻咽癌患者临床预后的独立危险因素之一。
　　 4.ALDH1与上皮细胞一间充质细胞转化(EMT)关系的分析
　　 1)免疫组织化学方法检测了在122例鼻咽癌组织中E-cadherin、Vimentin表达。结果显示,E-cadherin在大部分鼻咽癌中表达较低,而Vimentin在大部分鼻咽癌中表达较高。spearman秩相关分析ALDH1表达与E-cadherin和Vimentin表达的关系,结果显示,ALDH1表达与E-cadherin表达呈负相关(r=-0.264,p=0.003)；而与Vimentin表达呈正相关(r=0.240,P=0.008)。
　　 2)荧光定量PCR结果显示,E-cadherin在ALDH1+细胞的表达低于在的达ALDH1-细胞(t=19.824,P=0.000)。相反,vimentin在ALDH1+细胞的表高于ALDH1-细胞(t=5.533,p=0.005)。
　　 3)免疫荧光结果显示,E-cadherin在ALDH1+细胞低表达,在ALDH1-细胞的高表达,相反,vimentin在ALDH1+细胞高表达,在ALDH1-细胞的低表达。
　　 结论：
　　 1.通过体外实验提示ALDH1+细胞具有自我更新、增殖、侵袭、转移能力;体内实验提示ALDH1+细胞具有很强的肿瘤形成能力。ALDH1+细胞具有肿瘤干细胞样特性,可以作为鼻咽癌干细胞的功能性标记物。为以后研究鼻咽癌干细胞提供了一个平台。
　　 2.ALDH1+细胞和SP细胞存在交集。
　　 3.ALDH1的表达与鼻咽癌的临床预后相关,是影响鼻咽癌的临床预后独立风险因子之一,这对鼻咽癌患者临床预后的评判提供了一条思路。
　　 4.ALDH1+细胞具有上皮细胞-间充质细胞转化的性质。