鸟分枝杆菌脂类降低小鼠抗结核免疫反应的研究

摘要

尽管WHO在全世界160多个国家进行了BCG疫苗的接种,但是结核感染仍然高发。这种形势一方面是由于结核耐药菌株的出现,从而导致结核治疗上的困难；另一方面则与BCG疫苗的保护性下降有关。除BCG疫苗自身需改进的因素,环境中普遍存在的非结核分枝杆菌诱导的机体反应性的改变被认为是导致疫苗保护性下降的重要原因。然而这些非结核分枝杆菌通过何种方式和机制来调控机体的抗结核免疫,目前尚不清楚。
　　 鸟分枝杆菌是一种在环境中普遍存在的机会致病菌。鸟分枝杆菌在细胞壁的构成上与其他种属的细菌有着很大的差异,它的细胞壁主要由大量的脂类构成。目前对鸟分枝杆菌及其脂类的研究主要集中在其急性感染的致病机制及其对机体抗结核免疫的影响。然而在实际生活中,人们更多的是暴露在低剂量接触鸟分枝杆菌的环境中,这种低水平、无明显临床症状的接触鸟分枝杆菌及其产物是否影响机体抗结核免疫尚未见相关的研究报道,这正是本研究拟进行探索的工作。
　　 在结核杆菌的致病性与免疫性中,巨噬细胞与淋巴细胞发挥着重要的作用。T淋巴细胞介导的特异性免疫是机体清除结核杆菌的决定因素,结核杆菌及其抗原成份接触BCG致敏的淋巴细胞,可细胞毒作用杀伤感染细胞或通过释放IFN-γ激活巨噬细胞来杀伤并清除结核分枝杆菌。而巨噬细胞既是结核分枝杆菌感染并寄生的宿主细胞,也是胞内清除细菌控制感染的效应细胞,尤其是被T细胞释放的细胞因子激活的巨噬细胞是杀伤并清除结核杆菌的重要机制。但鸟分枝杆菌,尤其是低剂量的鸟分枝杆菌或产物是通过哪种细胞影响抗结核免疫尚不清楚。
　　 我们拟以BABL/c小鼠为实验对象,通过建立动物或细胞模型,观察MALs诱导对小鼠特异性或非特异性抗结核免疫的影响,阐明其作用的机制,并明确淋巴细胞和巨噬细胞在此过程中的作用。
　　 我们分离了小鼠腹腔巨噬细胞并成功构建了BCG免疫小鼠模型,在此基础上,我们评价了MALs对抗结核免疫的影响。我们发现MALs的诱导降低了小鼠的抗结核免疫力,减弱了小鼠对结核分枝杆菌感染的控制。这种免疫力的降低主要是通过减弱巨噬细胞对结核分枝杆菌成分和IFN-γ的反应性来实现的,而对淋巴细胞反应性的影响并不明显。本研究证实了MALs对机体抗结核免疫的影响,并对导致这种影响的机制作了初步的探讨,为解释结核感染的高发和防治结核提供了新的理论依据。
　　 第一章鸟分枝杆菌脂类的提取和鉴定
　　 为了给后续试验提供实验材料以及为实验中剂量的选择提供一定的依据,我们利用FOLCH法[1,2,3]提取了鸟分枝杆菌的脂类成分并对其进行了初步鉴定。同时对其内毒素含量、有无蛋白成分、细胞毒性以及体内外诱导的炎症水平进行了评价。
　　 鸟分枝杆菌在Middlebrook7H11培养基上生长为干燥、表面粗糙、菜花样的菌落。经抗酸染色后,油镜下可见抗酸染色阳性(红色),杆状,成团或堆排列的细菌,其染色性和镜下排列规则与预期相同。鲎试剂是检测内毒素含量的公认方法,我们用该方法检测了鸟分枝杆菌脂类提取物中的内毒素含量。结果表明,鸟分枝杆菌脂类提取物中的内毒素含量较低,经计算每100μg脂类中内毒素含量<0.05EU,说明这种方法提取的脂类中内毒素含量可以满足研究的要求。用于作为溶剂对照的DMSO其内毒素含量也符合要求。
　　 由于我们的研究涉及免疫细胞的低反应性,而细胞毒性对低反应性存在影响,因此我们分别用流式细胞术和CCK-8的方法评价了鸟分枝杆菌脂类对实验中涉及的多种细胞的细胞活力的影响。流式结果表明,10μg/ml及以下浓度的鸟分枝杆菌脂类诱导后,Raw264.7细胞和小鼠脾细胞存活率与Medium和SC诱导组相似,统计学差异不显著(F=0.631 P=0.652)。CCK-8法检测结果也说明,10μg/ml及以下浓度的鸟分枝杆菌脂类诱导后,小鼠腹腔巨噬细胞存活率与Medium和SC诱导组相似,统计学差异不显著(F=0.090 P=0.981)。
　　 由于我们希望模拟现实生活中人们慢性接触低剂量鸟分枝杆菌的现象,所以要选择一个不会诱导明显炎症反应的合适的体内、体外诱导剂量。在体外诱导试验中,我们用0.1、0.5、1、10、20μg/mlMALs以及0.5μg/ml的LPS和LTA刺激小鼠腹腔巨噬细胞48h后,发现1μg/ml及以下组诱导产生的TNF-α和IL-6水平较低(F=271.44,P=0.000；F=206.16,P=0.000),而10μg/ml及以上组可以诱导明显的炎症因子产生增加。对相应基因表达水平的检测也表明1μg/mlMALs不会诱导明显的炎症(F=213.02,P=0.000； F=564.422,P=0.000)。在体内诱导实验中,我们用0.25、0.5、1mg的MALs和0.1mgLPS以及相应的对照腹腔注射小鼠,6h后采集血浆标本,检测其中TNF-α的含量。结果表明,与阳性对照LPS相比,MALs诱导了很低的炎症水平(F=38.67,P=0.001),而且这种诱导的低炎症水平在24h后下降到正常水平。基于上述这些实验结果,我们最终选择了1μg/ml及以下组(体外)和0.5mg(体内)鸟分枝杆菌脂类作为后续实验的诱导剂量。
　　 本章工作证实了鸟分枝杆菌脂类对研究中所涉及的细胞没有明显的细胞毒性,不影响它们的细胞活力。其中的内毒素含量符合研究的要求。同时根据不诱发可检出的或明显的炎症反应的实验设计原则确定了后续试验所用的剂量。
　　 第二章 MALs降低未接种BCG小鼠巨噬细胞对结核杆菌及产物的反应
　　 在机体的非特异性抗结核免疫中,由于特异性免疫尚未建立,淋巴细胞在其中所起作用不大,因此同时作为靶细胞和效应细胞的巨噬细胞的作用就显得尤为重要。我们以其为研究对象,在体外进行诱导后评价了其对胞内BCG的控制能力。结果表明,MALs诱导组,巨噬细胞胞内BCG的数量在各个时间点均多于大肠杆菌脂类对照(E.Coli.Lipids,ELs)组和DMSO溶剂对照(solventcontrol,SC)组(F=36.12 P=0.000)。ELISA结果显示,MALs诱导后,PPD和热灭活BCG刺激小鼠腹腔巨噬细胞产生的TNF-α、IL-6和NO减少(PPD:F=42.63 P=0.000；F=72.38 P=0.000；F=38.71 P=0.000:BCG:F=34.15 P=0.000;F=21.00 P=0.000；F=23.86 P=0.000)。real-time PCR结果也表明,MALs诱导后,PPD和热灭活BCG刺激小鼠腹腔巨噬细胞产生的TNF—α、IL-6和NO相应的基因表达水平明显下降(PPD:F=54.69 P=0.000；F=24.09 P=0.000；F=31.85 P=0.000BCG:F=76.06 P=0.000；F=30.25 P=0.000；F=30.05 P=0.000),且表现出一定的剂量依赖关系。对巨噬细胞吞噬功能的测定结果显示,这种差别并不是通过对巨噬细胞吞噬能力的影响来实现的,与ELs组和SC组相比,在各个时间点,1μg/ml MALs诱导组巨噬细胞对BCG的吞噬能力统计学差异不显著。ELISA和real-time PCR结果均表明,MALs诱导后,PPD和热灭活BCG刺激小鼠腹腔巨噬细胞产生的TNF-α、IL-6和NO及其相应的基因表达水平都明显减少,且表现出一定的剂量依赖关系。提示小剂量MALs诱导了巨噬细胞对结核杆菌及其产物的低反应性。
　　 NF-κB信号通路在调控促炎症因子和NO的产生中起着重要的作用,我们利用NF-κB荧光素酶报告基因研究了MALs对这条通路信号的影响。PPD和热灭活的BCG均能诱发NF-κB控制下的荧光素酶报告基因的表达活性显著增加,而MALs预处理后,它们诱导产生的荧光素酶活性显著下降(PPD:F=18.88P=0.002；BCG:F=11.94 P=0.000)。与此同时,我们对导致这种NF-κB信号减弱的机制作了初步的研究。Real-time PCR和WB结果显示,MALs诱导了更强的IRAK-M蛋白的表达。Raw264.7细胞和小鼠腹腔巨噬细胞经MALs诱导6、12、24、48h后,其IRAK-M蛋白和IRAK-M mRNA表达水平明显高于ELs诱导组和SC组,有统计学差异(F=228.36 P=0.000；F=147.54 P=0.00)。
　　 TLR2和TLR4是巨噬细胞识别结核分支杆菌的主要模式识别受体,因此我们检测了MALs诱导后巨噬细胞表面TLR2和TLR4的表达变化。1μg/mlMALs诱导后,巨噬细胞表面TLR2表达水平有所增高(F=1170.16 P=0.000;F=4.64P=0.022),而TLR4变化不明显。MALs诱导后,PPD或热灭活BCG刺激的TLR2和TLR4 mRNA表达水平也有类似现象。与SC组相比,MALs诱导组TLR2mRNA水平在诱导后6h和12h明显增加(F=66.91 P=0.000),而TLR4mRNA水平在各个时间点增加不明显(F=0.30 P=0.823)。这些结果提示,虽然巨噬细胞主要通过TLR2/4来识别结核分枝杆菌及其抗原并由此激活NF-κB通路产生促炎症因子和NO,但MALs诱导的这条通路信号的减弱却不是通过下调这两种模式识别受体的表达来实现的。
　　 本章工作证实了MALs可以诱导未接种BCG小鼠巨噬细胞对结核分枝杆菌及其产物的反应性降低,并减弱了巨噬细胞对胞内BCG菌生长的清除与控制。推测这种低反应性的诱导可能与NF-κB信号的减弱与IRAK-M表达的增强有关:但与TLR2和TLR4表达无明显关联。这些结果提示我们,暴露于低剂量鸟分枝杆菌的环境中,虽然不会出现明显的临床表现,但有可能使机体对再次的结核分枝杆菌的感染反应性降低。
　　 第三章 MALs对小鼠特异性抗结核免疫反应的影响
　　 为了研究MALs对特异性抗结核免疫的影响,我们建立了BCG免疫小鼠并以PPD刺激的足垫反应和脾细胞产生的IFN-γ的水平为评价指标的模型。结果显示BCG免疫后的小鼠足垫厚度的增加量明显高于未免疫小鼠(t=12.39P=0.000),PPD刺激的IFN-γ产生也明显高于未免疫小鼠(t=33.82 P=0.000)。提示BCG接种的小鼠具备了针对结核分枝杆菌及其产物的特异性免疫,该模型可以用于后续的研究。
　　 已知BCG除了可以作为疫苗使用外,还被作为结核分枝杆菌的替代品用于评估机体的抗结核免疫。我们用0.5mg的MALs腹腔诱导BCG免疫小鼠后,再次用BCG进行攻击。对肝脏和肺脏中的细菌数量进行测定的结果显示,MALs诱导小鼠的肺脏和肝脏中的BCG数量明显高于ELs组和SC组(F=27.32P=0.000:F=29.51 P=0.000)。对其肺脏切片的HE染色结果显示MALs诱导组的炎性细胞浸润明显多于ELs与SC对照,提示MALs诱导明显减弱了免疫小鼠对BCG感染的控制能力。以上结果证实鸟分枝杆菌脂类的诱导可以降低机体的特异性抗结核免疫,减弱控制结核分枝杆菌感染的能力。
　　 对于已进行BCG免疫接种并建立了特异性免疫的小鼠,无疑其淋巴细胞在抗结核免疫中应该发挥着重要的主导作用。我们曾推测MALs诱导的抗结核免疫的减弱很可能与淋巴细胞的免疫反应性变化有关。为此,我们用MALs对BCG免疫小鼠进行体内诱导后,分离其脾细胞,用PPD和热灭活BCG刺激,通过IFN-γ产生和淋巴细胞增殖实验加以评价。令人意外的是,MALs诱导对PPD和热灭活的BCG刺激的IFN-γ产生和淋巴细胞增殖反应与ELs诱导组及SC组相比无统计学差异。为了进一步证实淋巴细胞反应性的改变,我们分离了BCG免疫小鼠的脾细胞,用MALs进行体外诱导12和24h后,再用PPD和热灭活的BCG进行刺激。结果同样表明,MALs体外诱导后,PPD和热灭活的BCG刺激的IFN-γ产生与ELs诱导组及SC组相比统计学差异不显著(PPD:F=0.18P=0.906:F=1.47 P=0.323 BCG:F=0.48 P=0.698:F=0.83 P=0.504)。这些结果说明,MALs诱导的抗结核特异性免疫反应性的降低与淋巴细胞无明显关系。
　　 在抗结核特异性免疫的重要效应机制之一是通过活化淋巴细胞产生的IFN-γ激活巨噬细胞发挥杀菌作用。因此,我们也重点观察了巨噬细胞对IFN-γ的反应性。结果显示,MALs的预处理显著降低了IFN-γ诱导的巨噬细胞的杀菌效应,减弱了其对胞内细菌的控制能力(F=54.60 P=0.000)。我们的研究还证实了MALs诱导影响IFN-γ刺激的巨噬细胞产生TNF-α和NO,而TNF-α和NO在其对胞内细菌的清除中发挥着极为重要作用。与ELs组和SC组相比,MALs诱导组IFN-γ刺激的巨噬细胞TNF-α和NO的产生明显降低(F=10.65 P=0.004；F=32.41 P=0.000)。而另一个影响IFN-γ诱导巨噬细胞清除胞内细菌的重要机制是LRG-47,我们通过Real-time PCR的方法在体外评价了MALs对IFN-γ刺激的巨噬细胞LRG-47表达水平的影响。结果显示与ELs组和SC组相比,MALs诱导组IFN-γ刺激的巨噬细胞LRG-47 mRNA的表达并没有明显变化(F=0.079P=0.969)。
　　 本章工作证实了MALs可以降低获得性抗结核免疫,减弱机体对结核分枝杆菌的控制。初步的机制探索工作证实,MALs诱导的效应并不是通过改变BCG免疫小鼠淋巴细胞对结核分枝杆菌及其抗原的特异性反应来实现的,而是通过降低小鼠巨噬细胞对IFN-γ的反应性来影响其对细菌的清除。
　　 综上,本研究证实了低剂量MALs体内外诱导可影响未接种BCG与免疫接种BCG小鼠对细胞内与体内结核杆菌的清除,降低对结核杆菌及其产物的炎症细胞因子生成,减弱了BCG接种对细菌攻击肺部的保护力。MALs降低小鼠对结核杆菌的清除反应主要是通过影响巨噬细胞胞内清除细菌的能力,尤其是特异性免疫反应中对IFN-γ的反应性。上述发现可望为阐明普遍接种BCG情况下的结核感染高发的原因提供实验依据。