皱瘤海鞘抗单纯疱疹病毒I型的实验研究

摘要

目的:海鞘类动物(Ascidians)属脊索动物门的尾索动物亚门,广泛分布于世界各个海域中,自沿海水域至深海海底皆有其栖息,种类繁多,在自然界中已知有1500余种。海鞘在进化上所处的特殊地位,受到动物学者、进化论学者和内分泌学者的高度关注,已成为科学工作者竞相研究的热点之一。20世纪80年代以来,人们已发现海鞘类生物中含有肽类、生物碱类、聚醚类、大环内酯类、萜类等多种化合物,它们大部分具有抗肿瘤、抗病毒、抗微生物以及免疫调节、生物催化等生理活性。
　　 我国南海有着丰富的海鞘资源,目前已发现有66种,皱瘤海鞘[Styela plicata(lesueur)]是其中的一种。皱瘤海鞘是一种可以食用的海鞘,国内外有关其营养成分研究的报道很多,如氨基酸、多糖等。近年来,我们已经对其进行了基础的抗病毒实验研究,实验结果表示其在体内外对乙肝病毒都有良好抑制作用,提示其具有一定的抗病毒活性。为了进一步研究皱瘤海鞘的抗病毒药效,我们研究了皱瘤海鞘醇提取物对同是DNA病毒的单纯疱疹病毒Ⅰ型(herpes simlexvirus types-Ⅰ,HSV-Ⅰ)的抗病毒作用,并对其作用机理进行初步研究,为新型的抗HSV-Ⅰ药物的开发提供理论依据。
　　 方法:本课题可分为以下三个部分:
　　 1.皱瘤海鞘醇提物体外抗HSV-Ⅰ型药效学研究
　　 本研究以HSV-Ⅰ感染非洲绿猴肾细胞(vero细胞)为细胞模型,探讨了皱瘤海鞘醇提物体外抗HSV-Ⅰ活性的药效学作用。首先是应用MTT法检测皱瘤海鞘醇提物对细胞的毒性作用,将对数生长期vero细胞消化计数后接种于96孔培养板,培养24 h,形成单层细胞后弃培养液,加入对倍稀释成6个浓度的皱瘤海鞘醇提物(10,5,2.5,1.25,0.63,0.32 mg/mL),每浓度4个复孔,同时设4个正常对照孔,每天使用倒置显微镜观察细胞病变情况,继续培养3 d后,记录细胞病变情况。每孔加入MTT溶液20μL,于37℃继续培养4h后,每孔加二甲基亚砜150μL,充分混匀后用酶联免疫检测仪于波长570nm处测定各组细胞的吸光度,以反映皱瘤海鞘醇提取物对vero细胞增殖活性的影响；然后以不同浓度的皱瘤海鞘醇提物与病毒混合后直接感染细胞,每一浓度设4个复孔,同时设阳性药ACV对照组、正常细胞对照组及病毒对照组,置37℃,5％CO2培养箱培养72 h,每天使用倒置显微镜观察细胞病变情况,当病毒对照病变达75％～100％时,记录细胞病变情况,并使用用MTT法测定波长570nm处各组细胞的吸光度,按Reed-Muench法分别计算皱瘤海鞘醇提物和ACV对vero细胞的半数毒性浓度(TC50)、皱瘤海鞘醇提物和ACV的半数抑制病毒有效剂量(IC50)和治疗指数(TI)。
　　 2.皱瘤海鞘醇提取物体内抗HSV-Ⅰ的实验研究
　　 本实验通过研究皱瘤海鞘醇提物对实验动物单纯疱疹病毒局部感染和全身感染的治疗效果,探讨了其在体内抗HSV-Ⅰ药效作用。局部感染模型为单纯疱疹性角膜炎,选用健康豚鼠20只,按角膜划痕方法,以1％戊巴比妥钠生理盐水腹腔注射7.5ml/kg麻醉,用1ml注射器针头井字划痕(深度为角巩缘微有渗血为度),滴加1滴HSV-Ⅰ病毒培养液,闭眼按摩15-30秒,2天后以1％荧光素钠生理盐水溶液染色,裂隙灯显微镜下观察角膜病变(角膜上皮点状、树枝状、地图状着色及基质混浊)范围。按病变的深浅、形态、严重程度搭配分为3组,每组6对(12只眼),分别给予生理盐水、阿昔洛韦、皱瘤海鞘醇提物滴眼处理,3组均每天5次滴眼,每次1滴,连续15天,每隔3天用1％荧光素钠生理盐水溶液染色,裂隙灯显微镜下观察记录病情变化,以角膜病变评分作为指标；全身感染模型为腹腔注射病毒滴度为100 TCID50/0.1ml的病毒稀释液0.4ml,分别给予皱瘤海鞘醇提物或阿昔洛韦进行治疗,另设正常对照组和病毒对照组。持续给药7天,以死亡率、体重、肝脏组织病理形态学为指标,评价了皱瘤海鞘醇提物对HSV-Ⅰ全身感染小鼠的治疗作用。
　　 3.皱瘤海鞘醇提物抗HSV-Ⅰ作用机理的初步研究
　　 运用vero细胞体外药效筛选模型,采用细胞病变效应CPE法和MTT两种测定方法,三种不同的加药方式在细胞水平上探讨皱瘤海鞘乙醇提取物抗HSV-Ⅰ的作用机理。以不同剂量的皱瘤海鞘乙醇提取物作用于病毒复制周期的不同环节,探索其在宿主细胞内影响病毒复制过程的作用机理,揭示了皱瘤海鞘醇提物对HSV-Ⅰ的直接杀伤作用、对HSV-Ⅰ吸附的影响和对HSV-Ⅰ生物合成的抑制作用。
　　 结果:采用MTT法测得皱瘤海鞘醇提物对vero细胞的半数毒性浓度(TC50)为6.868mg/ml,而ACV对vero细胞的半数毒性浓度(TC50)为0.254mg/ml,药效学实验选择皱瘤海鞘醇提物的最大浓度为2mg/ml,阿昔洛韦的最大浓度为0.04mg/ml,所对应的细胞存活率均大于80％；MTT法实验结果表明皱瘤海鞘醇提物对HSV-Ⅰ所致的细胞病变有明显的抑制作用,半数抑制病毒有效剂量(IC50)为0.230 mg/mL,治疗指数(TI)为29.86。ACV的IC50为0.008 mg/mL,TI为31.75。两者效果相当。
　　 从实验结果可以看出,皱瘤海鞘醇提物滴眼第3天到15天,角膜病变迅速好转,非参数检验的Kruskal-Wallis H法检验结果显示第3天到15天治疗组平均秩和低于病毒对照组,各治疗组整体比较均有统计学差异(P<0.05),进而分别进行给药第三天、第六天、第九天、十二天、十五天时,皱瘤海鞘组与病毒对照组两独立样本非参数检验,结果提示从第3天到9天皱瘤海鞘组的实验动物与病毒对照组实验动物角膜评分均有统计学意义差异(P值均小于0.0167),皱瘤海鞘组动物愈合时间短,角膜病变程度轻。从实验结果可见,给药第12、15天各用药组与对照组的平均秩和差距缩小,皱瘤海鞘组的实验动物与不用药组的病毒对照实验动物角膜评分无统计学意义差异(P值均大于0.0167),这可能是对照组豚鼠部分角膜病变的自然愈合所致。初步的实验结果表明,经过皱瘤海鞘醇提物的治疗,实验动物角膜病变明显减轻,皱瘤海鞘醇提物对单纯疱疹病毒性角膜炎较为敏感,在体内具有一定抗病毒活性,对实验性单纯疱疹性角膜炎有明显的疗效。
　　 全身感染模型的实验中,皱瘤海鞘组小鼠死亡率比病毒对照组低,与病毒对照组比较,皱瘤海鞘组的死亡率有统计学差异(P<0.05)。此外,皱瘤海鞘组小鼠的体重也有不同程度的增加,重复测量方差分析显示,皱瘤海鞘醇提物治疗的小鼠,给药第六天的小鼠体重与病毒对照组相比,差异都有统计学意义(P<0.05)。从病理切片结果显示,与病毒对照组相比,皱瘤海鞘组小鼠其肝脏病理损害的减轻比较明显,说明皱瘤海鞘能有效地减轻感染小鼠肝脏的病理损害。
　　 实验结果显示不同浓度的皱瘤海鞘醇提物对HSV-Ⅰ病毒都有显著的直接杀伤作用,浓度为2mg/ml时,累积存活率为96.44％,抑制HSV-Ⅰ所致细胞病变的效果随浓度增加而增强,各浓度组的细胞吸光值与病毒对照组的吸光值比较,差异均具有显著性(P<0.01)；高浓度的皱瘤海鞘醇提物对HSV-Ⅰ病毒的复制有一定的影响,低浓度对其影响不大,最高浓度2mg/mL时,细胞累积存活百分率为74.52％,各浓度组的吸光值与病毒对照组的吸光值比较,差异均具有统计学意义(P<0.05)；对HSV-Ⅰ病毒吸附的影响作用较弱,2 mg/ml时,其细胞累积存活率达只有40.01％,当皱瘤海鞘浓度大于0.5mg/ml时,吸光值与病毒对照组的吸光值比较,差异均具有统计学意义(P<0.05),说明了高浓度的皱瘤海鞘对病毒的吸附有一定的作用。
　　 结论:本实验证实了皱瘤海鞘醇提物体外抗HSV-Ⅰ药效作用理想,随着浓度增加其药效作用就越强,具有良好的量效关系。与阳性对照物ACV相比,皱瘤海鞘醇提物对细胞毒性小,治疗指数高,对HSV-Ⅰ病毒都有显著的直接杀伤作用,高浓度的皱瘤海鞘醇提物对病毒的吸附、生物合成有一定的影响。在体内实验的局部模型和全身感染模型中,皱瘤海鞘均有一定的抗病毒作用,实验观察结果和特征都符合药物药效评价实验要求,提示皱瘤海鞘醇提物可以进一步应用于全面的抗单纯疱疹病毒实验研究的基础工作。
　　 本次课题再次提示我们,皱瘤海鞘是天然产物,具有低毒、高效的特点,不同于常用合成类抗病毒药,在发展新型抗单纯疱疹病毒药物中具有十分重要的意义,具有合成药所不具有的优点。因此,我们推测皱瘤海鞘作为一种高效低度的抗病毒药物,值得进一步研究和开发,具有广阔的前景。