结核杆菌培养滤液蛋白10参照品的制备及其检测方法的初步建立

摘要

背景：结核病是经呼吸道传播的慢性传染病,主要发生在肺部,是单一致病菌感染导致死亡率最高的世界性重要传染病。回顾性调查结果表明,我国结核病的误诊率可达24％,提高结核病的实验诊断率已刻不容缓。因此,利用简单、快速、准确的实验室检查尽早对结核病做出诊断对控制结核病疫情至关重要。目前结核病诊断的金标准是细菌学检查,但是涂片和培养的阳性检出率较低,而且细菌培养也较费时,无法对结核病做出及时的诊断[2]。由于机体受到结核菌感染后,体内首先出现的是结核抗原,因此检测结核抗原有重要的早期诊断价值,并且结核抗原的检测可以作为结核杆菌存在的直接证据,且可以避免结核病患者由于免疫应答低下导致的体液免疫检测或细胞免疫检测的“假阴性”,因此与检测结核分枝杆菌抗体相比,检测特异性抗原更有可能发展成为结核病早期、快速、特异的新型诊断方法。
　　 最早的结核杆菌抗原是将结核分枝杆菌培养在含有甘油的液体培养基中,经过滤除菌、浓缩制备而成,称为旧结核菌素。1932年以来,应用蛋白纯化手段进一步纯化旧结核菌素,所得产物即为结核菌素蛋白衍生物(purified proteinderivation of tuberculin,PPD)。PPD主要用于结核菌素皮肤试验(tuberculin skintest),由于其抗原成分复杂,大多成分为非结核分枝杆菌和卡介苗(BCG)所共有,因此特异性低,不能区分感染者和卡介苗接种者,同时对感染后期的开放性结核和全身性结核不敏感。
　　 培养滤液蛋白10(culture filtrate protein10,CFP10)是近年来从结核分枝杆菌培养滤液中发现的分子量约为10KDa的高度特异性抗原,为人型结核分枝杆菌和牛结核分枝杆菌所特有,卡介苗(BCG)及非致病分枝杆菌缺乏,具有良好的免疫原性,可作为诊断结核病的一个特异性候选抗原[3-4],但通常结核病患者血清或体液(痰、胸腔积液、脑脊液、关节积液等)中CFP10含量非常低,用ELISA、胶体金免疫层析等方法检测,难以达到理想的效果。
　　 时间分辨荧光免疫分析技术(time-resolve fluoroimmunoassay,TRFIA)是自80年代以来新发展起来的一种新型标记分析技术,与其它免疫标记分析技术相比,有其独特的优点。它克服了放射性免疫分析法(Radioimmunoassay,RIA)中放射性同位素带来的污染问题；克服了酶免疫分析法(Enzyme immunoassay,EIA)中酶不稳定的缺点；而且,由于镧系元素独特的荧光特点和TRFIA检测中采用的波长分辨和时间延迟技术,能够很好的消除背景荧光的干扰,并可通过解离增强技术,使荧光信号放大百万倍,使其灵敏度比普通荧光法(Fluoroimmunoassay,FIA)高出几个数量级,具有灵敏度高(10-8 mol/孔)操作简便、易自动化、标准曲线范围宽、不受样品自然荧光干扰、标记物制备简便且稳定、无放射性污染、多标记等特点[5],目前已经成为了一种极具临床应用潜力的超微量分析技术。
　　 我们通过基因工程技术制备了CFP10的三种重组蛋白,CFP10及链亲和素标记的CFP10/SA,将重组抗原进行纯化、复性、鉴定后,应用时间分辨荧光免疫分析技术,以双抗体夹心法建立反应模式并优化条件。然后分别对CFP10、CFP10/SA在分析灵敏度、稳定性方面进行比较,筛选出最优的靶标蛋白做为检测CFP10的参考标准品,并初步建立了时间分辨荧光免疫分析检测CFP10的方法。
　　 目的：制备CFP10的三种重组蛋白,CFP10及链亲和素标记的CFP10/SA,从中筛选出合适的靶标蛋白做为检测CFP10的参考标准品,并初步建立时间分辨荧光免疫分析检测CFP10的方法。
　　 方法：
　　 1.重组质粒的构建根据CFP10的基因序列及所选载体的多克隆位点设计引物,以结核分支杆菌标准株H37RV全基因组为模板,加入PCR相关试剂,扩增CFP10片段,并根据设计的酶切位点与pET21a-SA载体及pET24b、pET24b-SA载体进行酶切后连接,转化DH5α感受态细胞,从转化抗性平板上挑取若干单克隆菌落,进行菌落PCR鉴定及双酶切鉴定,选择鉴定成功者送公司双向测序。
　　 2.重组蛋白的表达,纯化将测序正确的质粒转化大肠杆菌Rosetta,分别挑取3个单克隆菌落接种于3 ml LB标准培养基中,培养至OD600=0.4-0.6时,加入终浓度为1 mmol/L的IPTG,分别选用不同温度和不同的诱导时间进行培养,比较不同的实验条件对重组蛋白表达量的影响,对表达条件进行优化。根据最优培养诱导条件,大量扩菌表达,收集菌体,加入裂解液,冰浴超声裂解细菌,通过SDS-PAGE电泳分析蛋白的表达形式,并对包涵体表达的蛋白以本室发明的五步洗涤法予以洗涤。将洗涤后包涵体经8M尿素充分溶解后,经镍金属螯合层析柱(Ni-NTA)分离纯化,对于可溶性表达的重组蛋白则收集破菌后的上清经过滤后直接经亲和层析柱纯化。
　　 3.重组蛋白的复性及Western blotting鉴定将纯化后的变性蛋白浓度调整至0.2 mg/mL,在大于50倍体积的透析液(50mmol/L Tris-HCl,5 M尿素,0.5 M L—Arg,0.1％PEG8000,0.5 M EDTA)中,4℃尿素梯度(5M-3M-2M-1M-0M Urea)透析复性,每4h换液一次至0 M尿素,最后用50 mmol/L Tris-Hcl(PH8.0)缓慢透析12-24h,离心收集上清。并在透析过程中观察透析袋中蛋白的溶解度,是否浑浊或有沉淀形成,复性后蛋白经SDS-PAGE电泳观察复性效果。
　　 重组蛋白经SDS-PAGE电泳分离后,利用湿电转法将蛋白转移至PVDF膜上。0.2％的丽春红染色,观察转移效果,满意后,用封闭液(5％脱脂奶粉,PBST配制)37℃孵育2h,洗膜,加入封闭液稀释的小鼠CFP10单克隆抗体,37℃孵育2h,洗膜,加入PBST稀释的二抗HRP标记的山羊抗小鼠IgG,37℃孵育1h,充分洗膜后,加入DAB试剂显色,显色合适时,去离子水终止。
　　 4.时间分辨荧光免疫分析法检测CFP20参照品的筛选鉴定应用时间分辨荧光免疫分析技术,以双抗体夹心法对建立反应模式并对包被抗体和标记抗体的浓度进行优化。然后分别对CFP10、SA/CFP10在分析灵敏度、稳定性等方面进行比较,选择合适的靶标蛋白做为检测CFP10的参考标准品,并对参考标准品在线性、精密度及特异性等方面进行分析评价。
　　 结果：
　　 1.重组质粒的构建构建的三个重组质粒经DNA序列测定,测序结果与GeneBank中收录的SA及CFP10序列进行比对,均完全一致且无读码错误。
　　 2.重组蛋白的表达、纯化将测序正确的质粒转化大肠杆菌Rosetta,进行诱导表达,收集菌体经超声波破菌,SDS-PAGE电泳结果显示SA—CFP10及CFP10-SA分子量均在30KDa左右,与理论值基本相符,表达量分别约占菌体总蛋白25％和30％左右。CFP10分子量在10KDa左右与理论值基本相符,其表达量约占菌体总蛋白35％左右。融合蛋白SA/CFP10主要以包涵体形式存在于破菌后沉淀,而CFP10重组蛋白则以可溶形式存在于破菌后上清中。融合蛋白SA/CFP10洗涤包涵体后,可溶性CFP10重组蛋白过滤后,均经Ni-NTA,His—tag纯化,SDS-PAGE电泳结果显示,三种重组蛋白的纯化效果均较好,纯度均可达90％以上。
　　 3.重组蛋白的复性及Western blotting鉴定将纯化后的融合蛋白CFP10/SA置于透析袋内,于透析液中尿素梯度4℃透析复性,SDS-PAGE电泳结果可看到非还原条带上有聚体出现(链亲和素SA本身可形成四聚体)。将可溶性表达的CFP10于2M轻微变性后,以等同于CFP10/SA的复性条件复性。经Western blotting鉴定,三种重组蛋白均可与进口CFP10单克隆抗体发生特异性反应。
　　 4.时间分辨荧光免疫分析法检测CFP10参照品的筛选鉴定我们建立了时间分辨荧光双抗体夹心法,并对包被抗体和标记抗体进行浓度优化,以正交试验确定最优条件为:包被抗体浓度为3μg/mL,标记抗体浓度为0.8μg/mL。对自制的CFP10-SA、SA-CFP10及CFP10在分析灵敏度、稳定性方面进行了比较,证明CFP10-SA为最优,其线性范围为0-80ng/ml,最低检测浓度可达0.02ng/ml,分别在37℃放置7天,14天,21天,28天,其最大降解率低于8％,为最优。通过对其精密度分析,批内的CV<6％,批间的CV<5％,精密度良好。特异性实验结果证明,CFP10-SA与SA-IL15、SA-GM-CSF、ESAT6、SA-ESAT6、ESAT6-SA均无交叉反应,特异性良好。绘制双对数函数TRFIA标准曲线,其R2=0.9997,相关性良好,而且具有较好的重复性。该参考标准品的成功筛选,及双抗体夹心法时间分辨荧光免疫分析检测CFP10方法的初步建立,为进一步研究结核分枝杆菌培养滤液蛋白10时间分辨荧光分析检测试剂盒及其临床应用打下了基础。
　　 结论：
　　 1.成功制备了CFP10-SA、SA-CFP10及CFP10重组蛋白。
　　 2.初步建立了时间分辨荧光免疫分析法检测CFP10的方法,并筛选出了最优参照品CFP10-SA。