AHSP基因对β-地中海贫血表型的修饰及BCL11A基因在β-地中海贫血患者持续表达胎儿血红蛋白中的作用

摘要

第一部分 AHSP基因对β-地中海贫血表型的修饰
　　 背景与目的：
　　 β-地中海贫血(简称β-地贫)是一种遗传获得性的血红蛋白病,其特征是β-珠蛋白合成不足及α-血红蛋白过剩。过剩的α-血红蛋白在红细胞中积聚,会导致红细胞无效生成和循环红细胞的半衰期降低。因此,过剩的α-血红蛋白被认为是β-贫病理生理学改变及疾病严重性的主要决定因素。β-地贫是一种经典的单基因遗传病,但其临床表型差异很大；即便是在携带相同的β-地贫基因的不同个体之间,临床表型也不尽相同。一些能减少游离α-血红蛋白的遗传因素,如β-地贫合并胎儿血红蛋白持续表达或合并α-地贫,可以解释一些β-地贫个体之间的表型差异,但仍有许多β-地贫表型差异不能用已知的遗传修饰因素进行解释。人们由此推测可能有另外的遗传因素参与了β-地贫表型的修饰。
　　 α-血红蛋白稳定蛋白(α-hemoglobin stabilizing protein,AHSP)是一种能特异性结合游离α-血红蛋白,并阻止其凝集的分子伴侣,可中和游离α-血红蛋白对红细胞的毒性作用。正常小鼠的AHSP基因被敲除后,其红细胞生成异常,与β-地贫所表现的红细胞生成异常相似。更重要的是,β-地贫小鼠的AHSP基因被敲除后,其血液学表型异常会明显加剧。基于这些研究发现,人们提出AHSP基因可能具有修饰β-地贫表型的作用。
　　 先前已有多名学者研究了AHSP基因对β-地贫表型的遗传修饰作用,但一直未曾获得一个确切的研究结论。Lai等人报道AHSP基因是修饰β-地贫表型的数量性状遗传因子(quantative trait locus,QTL)。Galanello等人则报道AHSP基因表达差异与β-地贫表型有关。Vipraksit等人对来自泰国的120个临床表型不同的HbE/β-地贫复合杂合子个体,进行AHSP基因分型；结果未检测到AHSP基因突变,也未发现AHSP基因与β-地贫表型的严重程度之间存在关联。华南地区是β-地贫的高发区域之一,但有关AHSP基因对该地区β-地贫表型的遗传修饰作用的研究,目前尚未有文献报道。考虑到华南地区是β-地贫高发的区域及不同地区的β-地贫遗传基础(β-地贫突变谱)不同,研究AHSP基因对华南地区β-地贫表型的遗传修饰作用,将有重要意义。
　　 样本与方法：
　　 1.研究样本
　　 广西壮族自治区是华南地区β-地贫高发的最主要省份之一。我们从广西壮族自治区6个地市共收集5789例外周血样品。通过常规的血液学分析和DNA检测,从中发现370例携带β-地贫基因的样品,由于5例样品的DNA已用完,纳入本研究的β-地贫样品共计365例。在这365例β-地贫样品中,最常见的5种β-地贫突变依次是CD41-42(-CTIT)、CD17(A→T)、IVS-Ⅱ-654(C→T)、-28(A→G)和CD71/72(+A),其所占比例分别为42.90％、24.60％、9.02％、9.02％和6.28％。在这365例β-地贫样品中,364例为β-地贫基因杂合子,1例为β-地贫基因复合杂合子。有71例还同时携带α-地贫基因。
　　 2.实验室方法
　　 (1)血液学分析:β-地贫特征的血液学表型由红细胞指数及血红蛋白组成分析获得。红细胞指数采用全自动血细胞分析仪(Model Sysmex F-820,Sysmex Co Ltd,Kobe,Japan)进行检测。血红蛋白A(adult hemoglobin,HbA)、血红蛋白A2(minoradult hemoglobin,HbA2)、血红蛋白F(fetal hemoglobin,HbF)和其它异常血红蛋白用美国BIO-RAD公司生产的Hb自动分析仪ⅡVARIAN T(β-ThalassamiaShort Progran)进行检测。β-地贫的血液学诊断阳性指标:平均红细胞体积(meancorpuscular volume,MCV)小于803.5％。
　　 (2)α-地贫和β-地贫的突变分析:采用经典方法从外周血白细胞获得全基因组DNA。对经过血液学分析检测属于血红蛋白病的阳性样本进行基因分型分析以确定致病突变。用反向点杂交技术(reverse dot-blot,RDB)确定β-地贫的分子基础,该方法可同时确定11种在中国人群较为常见的β-地贫突变。β-地贫表型阳性的样品如果RDB检测结果呈阴性,需对其整个β-珠蛋白基因进行测序,以确定突变类型和位置。常见的α-地贫缺失突变(__SEA/、-α3.7/和-α4.2/)采用跨越断裂点PCR(gap polymerase chain reaction,Gap-PCR)进行检测,6种常见的非缺失α-地贫突变(αWSα/、αCSα/、αQSα/、αCD30α/、αCD31α/和αCD59α/)采用RDB技术进行检测。对所有β-地贫样品均需进行α-地贫突变检测,以确定其是否同时遗传了中国常见的α-地贫缺陷之一(__SEA/、-α3.7/、-α4.2/、αWSα/、αCSα/、αQSα/、αCD30α/、αCD31α和αCD59α/)。
　　 (3)AHSP基因的单核苷酸多态性位点的发现及其基因分型:通过变性高效液相色谱(denaturing high performance liquid chromatography,DHPLC)检测结合基因测序鉴定AHSP基因的单核苷酸多态性位点(single nucleotide polymorphism,SNP)。用六对引物PCR扩增长约1.5 kb的AHSP基因。检测范围包括转录起始位点上游451 bp的区域、整个mRNA编码区域、内含子序列和167 bp下游序列。在DHPLC分析之前,PCR产物在95℃变性5分钟,然后以1℃/min的速率冷却至49℃,以便形成杂交双链。用环球基因公司的WAVE DNA片段分析系统对变性产物进行分析。8μl变性的PCR产物以0.9 ml/min速率注入到流动相。根据PCR扩增产物的长度调整洗脱开始和结束时的洗脱梯度。往在线网站www.insertion.stanford.edu/melt.html的DHPLC熔链软件输入所检测的DNA片段的序列,可获得相应的柱温。
　　 (3)统计分析:采用卡方检验分析β-地贫表型不同组之间AHSP基因单倍型的分布差异和合并α-地贫的差异。通过单因素方差分析T18/T18基因型组,T18/T15基因型组和T15/T15基因型组之间的血液学参数。P<0.05则认为差异有显著性。采用SPSS软件进行统计分析,软件版本是SPSS13.0(SPSS软件公司,芝加哥,美国)。
　　 结果：
　　 我们在365例β-地贫样品中发现了六个常见的SNP(rs4499252、rs5816533、rs4296276、rs10843、rs8050390和rs17677)、两个新发现的罕见SNP、一个新发现的错义突变和一个罕见的错义突变。六个常见的SNP:两个位于第一个外显子的上游区域,两个位于第一个内含子,一个位于第三个外显子,一个位于在3’末端的非翻译区。这6个常见的SNP均已被报道过,其中四个SNP(rs4499252、rs5816533、rs4296276和rs17677)之间几乎完全连锁。在365例β-地贫样品中共有五种AHSP基因单倍型,分为两个主要单倍型类群(单体型类群A和单体型类群B)。五种单倍体型频率分别为22.8％、41.0％、14.9％、0.1％和21.2％。我们还鉴定了两个先前未被公开报道过的罕见SNP位点,每个SNP位点均只检出一个携带者。其中一个位于5’端的侧翼区(11810,G>A),另一个(12802,C>T)在氨基酸47位置引起同义突变。检测到一个新的错义突变(12750,A→T),引起AHSP第29个氨基酸由天冬氨酸转变为缬氨酸(AHSP D29V),有三个β-地贫样品检测到该突变。同时,还检测到一个罕见的错义突变(12831 T→G),该突变位于AHSP基因的第三个外显子,引起第56位氨基酸由缬氨酸转变为甘氨酸(AHSP V56G),仅有一例β-地贫样品检测到该突变。我们分析了4个携带AHSP基因突变的β-地贫个体的血液学表型,未发现明显异常。此外,还收集一个携带AHSP D29V突变的先证者的家系资料进行家系研究。从该家系共采集了18名家庭成员的资料,其中三名成员带有AHSP D29V突变,并同时携带有β-地贫基因。分析其血液学表型,未发现AHSP D29V突变导致β-地贫个体的血液学表型发生显著改变。
　　 在365例β-地贫样品中,有40例的血红蛋白水平较低(血红蛋白≤105g/dl),将其归属为血红蛋白较低组；其他样品的血红蛋白水平较高(血红蛋白>105g/dl),将其归属为血红蛋白较高组。合并α-地贫是目前公认的可修饰β-地贫表型的因素,在低Hb组与高Hb组之间,α-地贫的分布有显著性差异(x2=4.096,P=0.043)。然而,在低Hb组与高Hb组之间,AHSP基因单倍型类群A和单倍型类群B的分布无显著性差异(x2=2.016,P=0.365)。在AHSP基因启动子区域存在一个常见SNP位点rs5816533(12020 T18>T15),与等位基因T18相比,该SNP位点的等位基因T15会导致AHSP表达水平降低。有研究显示:携带等位基因T15的β-地贫个体的表型会更为严重。有研究者由此提出AHSP基因是修饰β-地贫表型的数量性状的遗传因素。我们分析并比较了14例等位基因T15纯合子(T15/T15)的β-地贫个体、223例等位基因T18纯合子(T18/T18)的β-地贫个体和128例等位基因T18/T15杂合子的β-地贫个体的血液学参数,结果表明三组之间的各项血液学参数均无明显差异。在剔除α-地贫的效应之后,我们仍然发现三组之间具有相似的血液学参数。即便是根据性别对三组之间的血液学参数进行比较,结果仍然无显著差异。
　　 讨论：
　　 β-地贫突变谱较广,为了全面评估AHSP基因对华南地区β-地贫表型的遗传修饰作用,必须有高质量的样品和足够大的样本量。因此,我们采用整群抽样从华南地区收集了5789例血液样本,并从中确定了365例携带β-地贫基因的样品。
　　 从这些β-地贫样品中鉴定出一种新的AHSP基因错义突变(AHSP D29V)和一种罕见的错义突变(AHSP V56G)。先前的研究已证实.AHSP与α-血红蛋白结合的主要部位包括其α1螺旋的羧基末端、α2螺旋的氨基末端以及α1螺旋和α2螺旋之间的连接环,AHSP D29V突变位于α1螺旋和α2螺旋之间的连接环,但先前的研究已经证明AHSP D29V突变不会影响AHSP与α-血红蛋白的结合。AHSP V56G突变不在此区域。新近的研究已证实该突变不会影响AHSP与α-血红蛋白的结合,但AHSPV56G的稳定性下降和更容易降解。与α-血红蛋白结合后,相对野生型AHSP而言,AHSPV56G更容易发生解离,稳定α-血红蛋白的能力低于野生型AHSP。但我们的研究显示:这两个错义突变均不会导致β-地贫表型发生明显改变。先前研究发现的导致异亮氨酸变异为天门冬氨酸的AHSP12888A→T突变,可导致AHSP蛋白中和游离α-血红蛋白毒性的作用降低,有研究者推测该突变可能具有修饰β-地贫表型的作用,但在本文所检测的365例β-地贫样品中未发现携带该突变的个体。本研究表明:在华南地区的β-地贫个体中,AHSP基因突变非常少见,AHSP基因通过突变对β-地贫表型发挥遗传修饰作用,不是一个常见现象。
　　 同时,我们还分析了AHSP基因与β-地贫表型严重程度之间的相关性。虽然发现合并α-地贫可缓解β-地贫个体的临床表型,但AHSP基因与β-地贫表型的严重程度之间并无显著相关性。伴有一个α-珠蛋白基因数增多(ααα/αα)和一个β-珠蛋白基因突变的β-地贫个体,可表现为轻型β-地贫,也可表现为中间型β-地贫。Lai MI等人发现9个此类β-地贫个体的临床表型较预期为重,均表现为中间型β-地贫。同时,其AHSP基因的T15等位基因的频率显著升高,而T15等位基因可导致AHSP表达减少。Lai MI等人推测:等位基因T15导致了AHSP表达减少,并进而加剧了β-地贫表型；并由此提出AHSP基因是β-地贫表型的数量性状的遗传修饰因子。在本研究所涉及的365例β-地贫样品中,也发现了3例伴有一个α-珠蛋白基因数增多和一个β-地贫基因的中间型β-地贫样品；但其等位基因T15的频率未有明显升高。此外,我们分析并比较了分别为等位基因T15纯合子、等位基因T18纯合子或T18/T15杂合子的β-地贫样品的血液学参数,三组β-地贫样品之间的血液学参数无明显差异。考虑到71例β-地贫个体同时合并α-地贫,而α-地贫本身也可影响血液学表型,在关联研究中可能会掩盖AHSP基因对β-地贫表型的遗传修饰作用。因此我们在剔除了合并α-地贫的个体后,再次比较了三组β-地贫个体之间的血液学参数,但是仍然得到相同的结果。AHSP基因有一个常见的SNP位点rs4296276(12391 G>A),该SNP位点的等位基因A可以通过干扰转录因子Oct-1结合而减少AHSP基因的表达,因此被认为可能具有修饰β-地贫表型的作用。在本研究的365例地贫个体中,rs4296276的等位基因A与等位基因T15完全连锁,等位基因A与β-地贫表型的严重程度之间也无关联。本研究表明:在华南地区,AHSP基因不是β-地贫表型的数量性状的遗传修饰因子。
　　 正常小鼠的AHSP基因敲除后,会表现出与β-地贫小鼠类似的异常病理学特征。同时,β-地贫小鼠的AHSP基因完全缺失后(AHSP-/-),血液学表型异常会明显加剧。这提示AHSP表达量或功能的改变可发挥修饰β-地贫表型的作用。相对野生型AHSP而言,AHSPV56G更容易降解,稳定α-血红蛋白的能力也下降；但在本研究中发现:携带该基因突变的β-地贫个体的血液学表型无明显异常。AHSP基因12391位的等位基因A和12020位的等位基因T15会导致AHSP低表达,但是我们的研究却表明这两个等位基因对β-地贫表型无明显的遗传修饰作用。我们试图从以下几个方面进行解释。AHSP能中和游离的α-血红蛋白对红细胞的细胞毒性作用,但在β-地贫个体或β-地贫小鼠的红细胞内,相对AHSP的量而言,游离的α-血红蛋白的量要大得多。因此,AHSP中和游离α-血红蛋白毒性作用的能力下降,并不会加剧β-地贫个体的临床表型。β-地贫小鼠的两个AHSP基因均缺失时(AHSP-/-),其红细胞内完全无AHSP表达。由于在HbA的装配过程中无AHSP稳定新生α-血红蛋白,将有更多的α-血红蛋白沉积甚至β-珠蛋白沉淀,血液学表型异常也会相应加剧。AHSP12391位的等位基因A和12020位的等位基因T15仅引起AHSP表达减少,AHSP V56G稳定α-血红蛋白的能力也仅部分降低。与此同时,在β-地贫个体体内,β-珠蛋白基因变异会导致β-珠蛋白表达明显降低,HbA装配也会显著减少,AHSP在HbA装配过程中的需要也相应减少。因此,AHSP基因因为携带等位基因A或等位基因T15所造成的表达减少,携带AHSP V56G所导致的稳定α-血红蛋白的能力降低,不会加剧β-地贫个体的血液学表型。先前的动物研究也观察到类似的结果,在AHSP基因正常的(AHSP+/+)β-地贫小鼠与缺失一个AHSP基因的(AHSP+/-)β-地贫小鼠之间,其血液学参数无明显差异。我们推测,如果β-地贫个体的AHSP表达或功能完全丧失,或不能满足HbA装配所需,应该会表现出更为严重的血液学表型；但从实际情况来看,AHSP的表达或功能完全丧失或不能满足HbA装配所需的个体在人群中非常罕见。如本次研究所涉及的365例β-地贫个体中未曾检测到一例这样的个体。本文针对AHSP基因的表达减少或稳定α-血红蛋白的能力下降,但β-地贫个体的表型无明显改变的现象,给出了科学解释；并提出科学推测:在其它人群中,如果不存在严重影响AHSP基因表达或功能的基因多态性,AHSP基因也不能对β-地贫表型发挥遗传修饰作用。
　　 结论：
　　 AHSP基因不是华南地区β-地贫表型的遗传修饰因子。
　　 第二部分 BCL11A基因在β-地中海贫血患者持续表达胎儿血红蛋白中的作用
　　 背景与目的：
　　 正常人成年后通常不表达胎儿血红蛋白(fetal hemoglobin,HbF)或表达量极低,但β-地贫患者在成年后仍持续高表达HbF。人们很早就认识到这一临床常见现象,但其分子机理一直未被阐明。目前已明确了一些与HbF持续表达有关的基因及其变异如β-珠蛋白基因簇大片段缺失、Corfu缺失、Aγ/Gγ-珠蛋白基因启动子区特定的点突变等,但这些基因及其变异均不能就β-地贫患者持续表达HbF的现象,给出合理的解释。
　　 BCL11A基因是一新近发现的与HbF表达有关的基因,其蛋白产物是抑制γ-珠蛋白基因转录的反式作用因子。同时,BCL11A基因与β-地贫患者的HbF表达水平之间存在显著相关性。基于以上研究,研究者推测BCL11A基因表达减少或表达缺如是β-地贫患者持续高表达HbF的直接原因或原因之一。
　　 鉴于正常人、β-地贫基因携带者及β-地贫患者的HbF表达水平有显著差异,研究者试图通过比较三者的BCL11A基因表达水平,阐明BCL11A基因在β-地贫患者持续表达HbF的过程中所起作用,初步揭示β-地贫患者持续表达HbF的分子机理。
　　 材料与方法：
　　 1.外周血样品:正常个体的血液样品来自本实验室的志愿者,β-地贫患者的血液样品来自广西南宁303医院血液内科。
　　 2.检测BCL11A基因在外周血网织红细胞的表达:取1 ml外周血样品,用红细胞裂解液将红细胞完全裂解后,离心收集细胞团块,按Trizol试剂说明书提取RNA,采用RT-PCR检测BCL11A基因的mRNA表达。
　　 3.检测BCL11A基因在体外培养的有核红细胞的表达:从正常个体采集50 ml外周血或从β-地贫患者采集10ml外周血,密度梯度离心分离其单个核细胞后,接种到培养液中,进行体外二阶段培养。待红系细胞分化为有核红细胞后收集细胞,按Trizol试剂说明书提取RNA,采用RT-PCR检测BCL11A基因的mRNA表达。
　　 结果与讨论：
　　 考虑到外周血中的网织红细胞尚残留部分mRNA,且外周血样品比较容易获取,研究者首先试图采用外周血细胞作为实验材料,但研究者在多个正常个体来源的外周血细胞中均不能监测到BCL11A基因的表达,说明本研究不能通过直接比较正常人、β-地贫基因携带者及β-地贫患者来源的外周血细胞中BCL11A基因的表达差异,分析BCL11A基因在β-地贫患者持续表达HbF的过程中所起作用。
　　 采用二阶段培养法体外培养的外周血红系细胞,能模拟红系细胞在体内的分化成熟。研究者转而考虑从正常人、β-地贫基因携带者及β-地贫患者采集外周血,采用外周血红系细胞二阶段培养法进行体外培养,待红系细胞分化为有核红细胞时收集细胞,通过比较BCL11A基因在三者的有核红细胞内的表达情况,验证研究者提出的科学推测。但正常人来源的外周血体外二阶段体外培养后,在所收集的有核红细胞内不能检测到BCL11A基因表达。我们推测是体外培养导致正常人来源的外周血细胞不表达BCL11A基因,同时也说明本课题也不能采用外周血体外二阶段体外培养的有核红细胞作为研究材料。
　　 来自骨髓的有核红细胞尚有完整的细胞核,且直接来从体内,未经历体外培养,应该能比较真实地反映.BCL11A基因在体内的表达情况。我们拟从正常人、β-地贫基因携带者及β-地贫患者的骨髓样品中分离有核红细胞,通过分析比较BCL11A基因在三者的有核红细胞内的表达情况,验证BCL11A基因表达减少或缺失是否为β-地贫患者持续表达HbF的原因。