枸橼酸钾对三聚氰胺氰尿酸盐肾结石大鼠的干预研究

摘要

研究背景
　　 2007年3月美国大量动物因食用含有三聚氰胺与三聚氰酸的宠物饲料发生急性肾衰竭而死亡。这些中毒宠物均出现尿毒症症状,并伴有血尿、食欲减退、呕吐、昏睡等多种症状。在死亡宠物的在肾脏组织内远曲小管或者集合管内发现出现的特异性结晶。这些结晶经红外光谱证实为三聚氰胺-三聚氰酸混合物。Puschner等对猫进行了三聚氰胺及其同系物的毒性研究发现单独喂含有三聚氰胺的饲料持续10天,在猫的肾功能上没有观察到明显的变化,在肾脏内也没有见到肾内晶体形成。而以三聚氰胺和三聚氰酸的饲料喂猫,猫出现急性肾功能衰竭,在猫的尿液和肾组织切片中可以观察到暗黄色的晶体形成。Reimschuessel等用三聚氰胺和三聚氰酸各400mg/kg来灌胃4种不同的鱼,在鱼的组织内发现三聚氰胺及三聚氰酸二者的残余。梁毅文等的研究也证实了单独利用三聚氰胺(30mg/kg-400mg/kg)或者三聚氰酸(30mg/kg-400mg/kg)单独灌胃大鼠没有发现对肾脏功能有影响,而利用三聚氰胺与三聚氰酸联合灌胃SD大鼠,不管是三聚氰胺和三聚氰酸各30mg/kg还是各400mg/kg均可以在大鼠尿液或者肾脏内观察到特异性的结晶形成,并经红外光谱证实该结晶为三聚氰胺氰尿酸盐,该晶体可对肾脏造成损害,在400mg/kg大剂量时一周内观察到大鼠因急性肾衰竭死亡。Takahiro Kobayashi等的研究也证实了联合灌胃三聚氰胺与三聚氰酸(12—120mg/kg)可致大鼠肾结石,在肾脏内同样可以观察到结晶的形成。
　　 据中国卫生部的报道,截止到2008年11月,294000名婴幼儿因食用含有三聚氰胺的问题奶粉而发生泌尿系统疾病,其中50000多名儿童住院,更为严重的是其中6名儿童因急性肾衰竭而死亡。在这些受影响的婴幼儿中,很多发生泌尿系结石。对于三聚氰胺问题奶粉儿童的结石成分分析显示,梁军对5例问题奶粉术后结石成分分析为二水尿酸和尿酸胺。南京大学孙西钊对南京地区问题奶粉患儿结石成分分析也得到相同的成分。北京儿童医院对问题奶粉患儿结石成分分析表明了含有三聚氰胺和尿酸。Grases F等报道了一例儿童由于食用含有三聚氰胺的奶粉引起膀胱结石,通过结石成分显示为三聚氰胺和尿酸的混合物。三聚氰胺可以在尿液中形成结晶当它的浓度超过最低限量。三聚氰胺因为其含氮量较高(66.67％)而被不法商人掺入到食品中来虚假提高其蛋白含量。在中国的一些问题奶粉中,也可以检查到含有三聚氰胺及三聚氰酸。而且,在其他食品中,比如饼干、液态奶、奶糖、巧克力等制品中也发现含有不同浓度的三聚氰胺及三聚氰酸。三聚氰胺是工业上广泛应用的工业产品,主要用来制造三聚氰胺甲醛树脂,也可以用来生产涂料、塑料、粘合剂、厨房台面、餐具等。三聚氰酸也广泛用来自来水、游泳池的消毒。
　　 中国卫生部专门针对婴幼儿三聚氰胺泌尿系结石的治疗而发表了《与食用受污染三鹿牌婴幼儿配方奶粉相关的婴幼儿泌尿系统结石诊疗方案》。其中碱化尿液是治疗的方法之一。枸橼酸钾是常用的尿液碱化剂,是治疗和预防泌尿系结石的常用药物,可以抑制盐结石(草酸钙、磷酸钙和尿酸)的形成和复发。许多研究表明枸橼酸钾在治疗和预防含钙结石、尿酸结石有一定疗效。本研究旨在建立三聚氰胺氰尿酸盐肾结石模型,研究枸橼酸钾对三聚氰胺氰尿酸盐肾结石的干预作用,为进一步寻求防治方法及临床上治疗问题奶粉所致泌尿系结石提供实验依据。
　　 研究目的:
　　 1.研究联合灌胃三聚氰胺与三聚氰酸制造三聚氰胺氰尿酸盐大鼠肾结石的模型的机制,提供一种新的复制大鼠肾结石模型的方法。
　　 2.研究枸橼酸钾对三聚氰胺氰尿酸盐肾结石大鼠的干预机制。
　　 研究方法:
　　 1.造模和分组
　　 将36只SD雄性大鼠随机分成A组(空白对照组)、B组(三聚氰胺30mg·kg-1·d-1+三聚氰酸30mg·kg-1·d-1)、C组(三聚氰胺30mg·kg-1·d-1+三聚氰酸30mg·kg-1·d-1+枸橼酸钾1g·kg-1·d-1),每组12只,通过灌胃给药。以上各药均配置成2 ml液体每只每次灌胃。
　　 2.指标的收集和检测
　　 动物饲养2周,每天观察动物的一般情况,如饮食、活动、尿液情况、精神状态等。用代谢笼收集第1天、第14天24h尿液。取第1天尿液,涂片观察尿液沉渣情况。取第14天尿液,测24h排尿量和尿pH值。14天后大鼠处死前称体重,从下腔静脉采血检测血液肌酐、血尿素氮和血尿酸。取双肾,称双肾重量,计算肾体比,肾体比=双肾重/体重×100％。用外科显微镜观察肾脏大体变化情况。取左肾进行HE病理切片,并对肾脏病理切片观察病理变化及三聚氰胺氰尿酸盐结晶情况,并按文献标准进行分级。结晶的分级程度用半定量评估为:0级:无任何结晶亮点；Ⅰ级:很少的结晶亮点；Ⅱ级:一些结晶亮点；Ⅲ级:许多结晶亮点,广泛连接成片。
　　 3.统计学处理
　　 采用SPSS13.0统计软件进行统计学处理,数据以 x±s表示。肾内结晶评分采用非参数检验(秩和检验)的Mann—whitney U检验。尿液、血生化采用方差分析。当P<0.05时,表明差异有统计学意义。
　　 结果:
　　 1.动物一般情况
　　 A组(空白组)大鼠饮食、活动未见异常,精神状态正常；但是在B组的情况明显不同。B组(模型组)大鼠的症状表现为精神萎靡、嗜睡、进食少、逐渐出现尿少,前三天时大多数老鼠出现肉眼血尿,并出现体重的减少；而C组(干预组)活动度稍差、饮水量增加,并出现尿量增加,部分大鼠出现肉眼血尿。各组大鼠在实验过程中均未见大鼠死亡。
　　 2.肾脏大体标本改变
　　 外科显微镜下观察发现A组大鼠肾脏表面光滑暗红色,肾皮质剖面呈红褐色,肾髓质呈浅红色,肾皮质、髓质无结晶形成；B组大鼠肾脏明显肿大,外观呈灰黄色,包膜有许多散在黄色斑点,肾脏皮质变薄,肾盏、肾盂结构破坏,肾内布满淡黄色颗粒,可见沿髓线放射状排列的黄色条索状沉淀物,并在皮髓交界处形成一道明显的淡黄色弧线；C组大鼠肾脏表面尚光滑,颜色为暗红色,但亦可见少量暗黄色颗粒散布在肾脏表面,皮髓结构尚清晰,有少量淡黄色颗粒沉积,颗粒结晶较B组明显减少。
　　 3.肾重、体重、肾体比
　　 B组表现为体重减轻,显著低于A组和C组(P<0.05)；B组双肾质量增大,显著高于A组和C组(P<0.05)。A组和C组肾重、体重、肾体比无统计学意义(P>0.05)。
　　 4.各组大鼠血尿生化
　　 B组大鼠24尿量、尿pH值,较A组、C组显著减少,均为P<0.05,具有统计学意义；血液肌酐、血尿素氮、血尿酸较A组、C组显著增加,差异具有统计学意义(P<0.05)。C组24h尿量、尿pH值较A组显著增加,差异具有统计学意义(P<0.05)；C组血液肌酐、尿素氮与A组无统计学意义(P>0.05)。
　　 5.尿沉渣检测
　　 尿沉渣用偏光显微镜观察。空白组A组未见明显晶体及杂质；B组可见较多的、呈淡黄色半透明的放射状同心圆形晶体,大小不等,其中有部分晶体呈融合在一起的形态；C组也可见许多和B组一样的晶体,同样呈暗黄色半透明同心圆形状。
　　 6.肾组织病理及结晶分级评分
　　 A组大鼠HE染色肾组织切片未见晶体形成,细胞排列整齐,规则,结构清晰,肾小管腔内无沉积物,上皮细胞无肿胀充血肾乳头肾盂肾盏清晰,肾脏皮质、髓质均无结石。对B组肾脏组织切片进行观察,可见到许多淡黄色、半透明、呈放射状的同心圆或椭圆形结石晶体,这些晶体直径范围大约在10—200μm之间,有些结晶相互靠近,聚集在一起呈联合扩大的趋势,堵塞于肾小管;这些结晶主要集聚于肾小管,部分见于集合管、间质及被膜下,偶见于肾小球囊中,大多晶体以不规则碎片出现于肾小管中,肾小管管腔明显增大,显著大于正常组的肾小管的管腔；此外,肾小管上皮细胞受损,并出现各种管型和坏死细胞,有大量炎性细胞浸润在在肾小球囊腔、肾小管及间质中。C组同样可见三聚氰胺氰尿酸结晶,结晶数量较模型组少,主要聚集在肾小管管腔中,直径大约在10μm-50μm之间,少部分可见于集合管,间质及被膜下很少见结晶沉积,肾小管损伤情况无B组明显,可见少量炎性细胞及坏死细胞。B组的平均结晶分级评分为(1.44±0.86),C组的各组结晶分级评分为(0.54±0.62),采用用非参数检验(秩和检验)的Mann-Whitney U检验,Z=14.147,P=0.000,C组结晶平均分级得分显著低于B组,具有显著的统计学意义。
　　 结论:
　　 1.三聚氰胺和三聚氰酸同时混合灌胃进入体内,可形成三聚氰胺氰尿酸盐肾结石晶体,利用三聚氰胺与三聚氰酸联合灌胃可形成三聚氰胺尿酸盐肾结石模型。
　　 2.利用枸橼酸钾对三聚氰胺氰尿酸盐肾结石模型进行干预,可以抑制三聚氰胺氰尿酸盐结石的形成。它的主要作用通过提高尿液pH值,利尿,及其加强结晶的溶解和排泄。