黑色素瘤相关抗原-A3在肺癌中的表达及临床意义的研究

摘要

肺癌是全世界范围内最常见的恶性肿瘤，也是全球癌症死亡的首要原因，严重威胁人类健康。在美国，肺癌在男性和女性的恶性肿瘤中的病死率均居第一位。2009年约有219440例肺癌新发病例，并有159390例肺癌患者死亡。在发展中国家，特别是中国，肺癌的发生率一直呈上升趋势。如果不积极控制吸烟和空气污染，到2025年我国每年肺癌患者将超过100万，成为世界第一肺癌大国。非小细胞肺癌(non small cell lung cancer, NSCLC)占全部肺癌约85％。尽管诊断方法及治疗手段的不断更新，NSCLC的治疗在过去的几十年并未取得突破性的进展，即使Ⅰ期的NSCLC患者，其5年生存率也只有50％，Ⅱ期患者，5年生存率只有30％，晚期患者，5年生存率仍然不到15％，肿瘤侵袭以及转移是肺癌患者死亡的主要原因。随着分子生物学技术的发展，分子标志物在NSCLC的辅助诊断、判断预后以及评估疗效中发挥着日益重要的作用。因此，大量的实验研究都在寻求敏感性和特异性都较高的分子标记物，可以早期诊断肺癌，评估疗效和判断预后。黑色素瘤相关抗原E-A3(melanoma-associated antigen-A3，MAGE-A3)是一种肿瘤-睾丸抗原，首先发现于黑素瘤细胞。它作为人类已经发现并鉴定的肿瘤特异性抗原，广泛表达于人体的多种肿瘤组织及细胞，如黑色素瘤、头颈部鳞癌、肝癌、肺癌、胃癌、乳腺癌等，而在正常组织中（除睾丸和胎盘外）不表达。有研究显示，30％～50％的NSCLC患者表达MAGE-A3，表明MAGE-A3在人类肿瘤形成、发展和转移的病理过程中可能起着非常重要的作用。
　　 研究目的:
　　 1.研究MAGE-A3在肺癌患者外周血中的表达规律，并分析其与肺癌临床病理特征的关系，初步探讨MAGE-A3在肺癌中的辅助诊断价值。
　　 2.判断MAGE-A3在肺癌疗效评估和预后判断中的价值。
　　 3.构建重组慢病毒载体PLV-MAGE-A3-GFP，并检测其在人肺癌细胞系A549的表达情况。
　　 材料与方法:
　　 1.研究对象（分为两部分）
　　 第一部分:肺癌患者，分三组；
　　 第二部分:非小细胞肺癌细胞株A549。
　　 肺癌组:共120例，选自2009年6月到2011年9月于南京军区南京总医院住院的患者，均为肺癌患者，未经治疗并计划接受至少1周期标准一线含铂的两药联合的化疗。入组的标准:
　　 (1)经细胞学或组织学证实为肺癌;
　　 (2)按照2009年国际肺癌研究协学会(International Association for the Study of Lung Cancer，IASLC)公布修订的UICC7th分期标准进行分期，Ⅰ-Ⅳ期NSCLC患者以及小细胞肺癌患者;
　　 (3)按ECOG PS评分为0-2分;
　　 (4)肝肾功能及血常规无明显异常，无其他并发病或并存病。
　　 肺良性病变组:共39例，为同期连续选取南京军区南京总医院住院患者。所有病例均经临床、影像学或病理学诊断为肺良性病变，其中肺炎25例，肺结核1例，发热菌血症1例，肺不张2例，间质性肺炎1例，慢性阻塞性肺疾病6例，支气管扩张伴感染3例。
　　 正常对照组:共32例，来自于南京军区南京总医院健康体检者，均无心、肝、肺和肾等重要器官疾病，肝肾功能，血常规以及其他辅助检查均无明显异常者。
　　 2.实验方法
　　 (1)外周血标本的采集:抽取健康志愿者及肺良性病变患者空腹外周静脉血5ml，肺癌患者在第1及第3个周期化疗前分别抽取空腹外周静脉血5ml。所有血样抽取后30min内进行离心(室温，2000RPM，10min)，吸出上清，留取下层血细胞沉淀，储存于-80℃深低温冰箱备用。
　　 采用TRIzol法提取外周血标本的总RNA，用酶标仪检测所提取总RNA浓度及质量，检测合格者采用反转录聚合酶链式反应(reverse transcription PCR，RT-PCR)方法反转录成cDNA，试剂盒均购自Formentas Life Sciences公司（美国）。采用实时聚合酶链式反应(real time PCR)方法的荧光染料法(SYBRGreen)检测外周血中MAGE-A3的表达水平，选用Takara公司提供的SYBR Green试剂，上述实验严格按照试剂盒的使用说明书进行操作。
　　 (2)利用DNA重组技术将黑色素瘤相关抗原-A3(MAGE-A3)基因克隆到带GFP的慢病毒表达载体质粒PLV中，经限制性酶切和测序鉴定真核重组载体。将重组慢病毒载体PLV-MAGE-A3-GFP与包装质粒pCMV-dR8.91及pCMV-VSV-G共转染人胚肾上皮细胞株293TAB，包装重组慢病毒LV-MAGE-A3-GFP，并感染人肺癌细胞株A549，观察绿色荧光状态，并采用Westernblot法检测MAGE-A3蛋白的表达情况。
　　 3.客观疗效评价标准
　　 所有肺癌患者于第1及3周期化疗前行全身检查，按照RECIST1.1实体瘤疗效评价标准，化疗疗效评估分为:完全缓解(complete response，CR)、部分缓解(partial response，PR)、病灶稳定(stable disease，SD)和病灶进展(progressive disease，PD)。CR:所有靶病灶消失;所有病理性淋巴结短径＜10mm;且肿瘤标志物降至正常;PR:评价5个靶病灶（每个器官≦2个病灶），以最初的靶病灶直径总和作为参照，其长径总和缩小至少30％; PD:以化疗过程中靶病灶直径的总和最小值为参照，靶病灶长径总和增加20％以上，并且其绝对值增加超过5mm。除此之外，出现新病变也视为PD; SD:靶病灶长径总和有缩小但未达PR或有增加但未达PD。CR和PR定义为有效，SD和PD定义为无效。
　　 4.随访
　　 以总生存期(Overall survival，OS)作为随访终点，OS定义为是指从随机化开始至因任何原因引起死亡的时间。7例患者失访。
　　 5.统计学分析
　　 采用SPSS17.0软件进行统计分析。定量资料描述采用例数、中位数、四分位间距。组间比较采用Kruskal-Wallis H检验。治疗前后组间比较采用Wilcoxon符号秩检验。定性资料描述采用例数和百分比(％)。组间比较采用Chi-square检验。等级资料采用Kruskal-Wallis H检验。MAGE-A3区分疾病良恶性的性能分析采用ROC曲线法，计算曲线下面积及其95％可信区间。采用Kaplan-Meier法描述MAGE-A3不同基线水平时肺癌患者的生存情况，两组生存情况的比较用log-rank检验。采用Cox回归模型分析肺癌患者生存时间的影响因素，计算相关因素的危险比(hazards rate，HR)。P≤0.05表示差异有统计学意义。
　　 结果:
　　 1.肺癌组、肺良性病变组、正常对照组患者的外周血MAGE-A3基因的表达量中位值分别为0.156，0.010，0.001。肺癌患者外周血MAGE-A3的表达水平高于肺良性病变组和正常对照组，差异有统计学意义(P＜0.001)。肺良性病变患者的外周血MAGE-A3的表达水平高于正常对照组，差异有统计学意义(P＜0.001)。
　　 2.通过建立ROC曲线确定外周血基线MAGE-A3基因水平区分良恶性的最佳截取值(cut-off)。MAGE-A3的曲线下面积(area under the ROC curve，AUC)为0.860(95％CI:0.809-0.911)。Cut-off值为0.115时敏感度(53.3％)和特异度(100％)最高。
　　 3.将120例肺癌组内的研究对象按性别、年龄（＜60岁和≥60岁）、分期、分化程度（中高分化和低分化）、病理类型（腺癌、鳞癌和小细胞癌）、有无淋巴结转移、原发病灶部位（左肺和右肺）、有无远处转移、有无吸烟史分成两组，然后进行比较，外周血MAGE-A3的表达水平在年龄、组织学类型、分化程度、淋巴结转移及原发病灶部位等方面无明显差异。伴有远处转移的患者外周血中的MAGE-A3的中位表达水平高于无远处转移的患者(0.407，0.024)，差异有统计学意义(P＜0.001)。Ⅲ-Ⅳ期NSCLC患者MAGE-A3的中位表达水平(0.238，0.003)高于Ⅰ-Ⅱ期的NSCLC患者，差异有统计学意义(P=0.005)。表明MAGE-A3在肺癌的表达可能与细胞增殖及远处转移相关。此外，既往有吸烟史的肺癌患者MAGE-A3的中位表达水平低于无吸烟史的肺癌患者(0.062，0.528)，差异有统计学意义(P＜0.001)。男性肺癌患者MAGE-A3的中位表达水平低于女性肺癌患者(0.062，0.559;P＜0.001)。
　　 4.120例肺癌患者中，收集了61例患者第1周期和第3周期化疗前的外周血，动态观察治疗的过程中MAGE-A3水平的变化情况。化疗后，外周血MAGE-A3水平较化疗前显著下降，差异有统计学意义(P＜0.001)。绘制ROC曲线，确定MAGE-A3下降率的最佳cut-off值，从而通过化疗前后MAGE-A3的变化情况来预测化疗疗效。根据ROC曲线分析，AUC为0.700(95％CI:0.551-0.850)，MAGE-A3下降率预测化疗疗效的最佳截取值为92.9％，此时敏感度和特异度都达到最高，分别是45.5％，97.4％，化疗后MAGE-A3下降率≥92.9％定义为MAGE-A3应答。MAGE-A3应答与无MAGE-A3应答的患者化疗疗效之间存在统计学差异(P＜0.001)。
　　 5.120例肺癌患者，整体OS中位时间为10.630个月。绘制生存曲线，外周血MAGE-A3低表达的患者(MAGE-A3＜0.115)OS时间（中位OS时间为20.930个月）长于高表达的患者( MAGE-A3≥0.115)（中位OS时间为6.500个月），差异有统计学意义(P＜0.001)。
　　 6.通过双酶切重组MAGE-A3和PLV-GFP慢病毒质粒载体可以构建出重组真核慢病毒表达质粒PLV-MAGE-A3-GFP。通过观察绿色荧光状态，并采用Western blot法检测MAGE-A3蛋白的表达情况，证实重组慢病毒载体质粒PLV-MAGE-A3-GFP与包装质粒pCMV-dR8.91及pCMV-VSV-G包装的重组慢病毒LV-MAGE-A3-GFP，可成功感染人肺癌细胞株A549。
　　 结论:
　　 1.MAGE-A3在肺癌患者外周血中的表达水平较肺部良性疾病组和健康对照组高，这表明MAGE-A3的异常表达与肺癌的发生有关。
　　 2.MAGE-A3在肺癌患者外周血中的异常表达与肿瘤的分期、远处转移相关，表明MAGE-A3在肺癌的增殖以及侵袭性中可能起着非常重要的作用。
　　 3.外周血中MAGE-A3的表达水平对肺癌的诊断有一定的辅助价值。
　　 4.MAGE-A3可以作为监测肺癌患者化疗疗效、判断预后的指标。
　　 5.通过DNA重组技术重组MAGE-A3和PLV-GFP慢病毒质粒载体可以构建出重组真核慢病毒表达质粒PLV-MAGE-A3-GFP。并通过与包装重组慢病毒成功感染人肺癌细胞株A549。
　　 总结:
　　 本实验采用Real time PCR技术检测肺癌患者、肺良性病变及正常对照者的外周血中MAGE-A3的表达水平，研究MAGE-A3的表达与肺癌发生、转移的关系，探讨MAGE-A3在肺癌中的诊断、疗效评价以及判断预后中的价值。此外，利用DNA重组技术将MAGE-A3基因克隆到带GFP的慢病毒表达载体质粒PLV中，体外构建重组慢病毒载体PLV-MAGE-A3-GFP，成功感染人肺癌细胞株A549，并使MAGE-A3基因得以稳定表达，为进一步对非小细胞肺癌(NSCLC)进行免疫治疗提供了实验依据。
　　 MAGE-A3是一种肿瘤特异性相关抗原，广泛表达于多种肿瘤组织，具有多种生物学功能，在肺癌患者的外周血中高表达，可能与肿瘤的增殖、侵袭和转移密切相关。此外，MAGE-A3可以作为肺癌预测疗效和判断预后的指标。深入研究MAGE-A3在肺癌中的表达、功能以及调控，有助于进一步认肺癌发生发展与转移的分子特点，可能为其提供新的治疗靶点。

目录

摘要

前言

第一部分 外周血MAGE-A3表达与肺癌临床特征关系的研究

1．前言

2．材料和方法

3．结果

4．讨论

参考文献

第二部分 MAGE-A3基因重组慢病毒载体真核质粒的构建及鉴定

1．前言

2．材料和方法

3．结果

4．讨论

参考文献

结论

总结

附录

综述

发表文章

成果

致谢

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