RhoA/ROCK信号通路在1-磷酸鞘氨醇介导的内皮细胞功能变化中的作用

摘要

研究目的:
　　 1-磷酸鞘胺醇（sphingosine-1-phosphate，S1P）是一种存在于血浆中的多效信号脂质分子，它的主要作用是作为一个细胞外配体，与几乎存在于所有细胞种类的S1P膜受体(S1P receptor，S1PR)一类G蛋白偶联受体结合，并通过各自的信号转导通路，影响细胞的生存、分化、运动等，发挥广泛的生物学效应。S1P特异性结合的G蛋白偶联受体共有5种，分别为S1PR1、S1PR2、S1PR3、S1PR4、S1PR5。血管内皮细胞主要表达S1PR1、2和3。其中内皮细胞S1PR1激活后与G蛋白偶联受体Gi结合，引起Rac1活性的增强;S1PR2和S1PR3则与Gq以及G12/13结合，导致RhoA的激活，并同时抑制Rac的激活，从而分别引起不同的生物学效应。Rac1和RhoA都是是小G蛋白Rho亚家族中的一员，属于重要的细胞信号转导的中介分子。S1PR1和S1PR2/3对S1P的亲和力也有区别，生理浓度下S1P主要与S1PR1结合，介导Rac1依赖的屏障保护作用;浓度较高（如超过10μmol/L时）则与S1PR2/3结合，介导RhoA依赖的屏障损伤作用。其中生理浓度的S1P对内皮细胞屏障功能的保护作用被认为具有重要的临床治疗意义，有可能为感染等病理状态下的组织炎症，特别是为血管通透性的升高所导致的组织水肿提供治疗途径。因此，深入研究S1P调节内皮细胞功能的作用和机制，对于将来在治疗上发挥并加强S1P的内源性血管通透性稳定因子的作用具有重要的意义。
　　 有研究证明S1P与受体结合后的信号转导通路和细胞内钙信号变化关系密切。内皮细胞钙离子浓度的变化主要来自两个途径，一个是由PLC和IP3及其受体介导的内质网的钙释放，另一个是钙池操纵的外钙内流离子通道。我们初步假设S1P与受体结合后的信号转导通路是:生理剂量的S1P通过S1PR1激活细胞内质网的钙释放，使细胞内钙离子浓度升高，导致Rac的激活和移位并最终引起细胞骨架蛋白聚集细胞周边，加强细胞间连接结构和屏障的完整性;过量的S1P通过S1PR2/3引起细胞外钙的内流，细胞内钙离子浓度升高，与RhoA协同，并通过RhoA下游靶效应分子ROCK的磷酸化，介导骨架蛋白的收缩，形成应力纤维，细胞间连接松懈和屏障功能损伤。本研究的主要工作是探讨高浓度S1P是否通过细胞外钙内流和RhoA/ROCK信号通路的激活，介导内皮细胞功能损伤;并厘清高浓度S1P刺激对PLC和IP3信号转导通路和细胞内钙释放之间的关系，为进一步探讨细胞内的钙信号时空动力学在S1P介导的内皮细胞屏障功能调节中的作用打下基础，并为临床处理炎症等引起的血管通透性升高和组织水肿提供新的思路。
　　 方法:
　　 体外培养人脐静脉内皮细胞株，分别接种于微孔小皿(petri dish)、直径6 cm和10 cm的细胞培养皿上，待细胞长至融合或接近融合时，换无血清培养基继续培养24 h，使细胞获得同步生长，然后按实验分组分别处理备用。选用不同浓度S1P并且结合S1PR1激动SEW2871、S1PR2拮抗剂JTE-013、PI-PLC抑制剂ET-18-OCH3、IP3抑制剂2-APB、细胞膜钙离子通道抑制剂钉红和ROCK抑制剂Y-27632等处理细胞;应用G-LISA试剂盒检测法检测RhoA活性;免疫印迹技术检测ROCK磷酸化水平，用免疫细胞化学的荧光染色法、激光共聚焦显微镜观察细胞内磷酸化ROCK形态和定位。
　　 结果:
　　 1.S1P对内皮细胞RhoA活性的影响及其机制
　　 (1)不同浓度S1P对内皮细胞RhoA活性的影响
　　 S1P对内皮细胞RhoA活性的影响具有时间效应和剂量依赖性。给予高浓度S1P(10μmol/L)刺激引起RhoA活性显著增加，RhoA活性在2 min分钟即到达峰值(P＜0.001)，随后逐渐降低，与空白对照组相比，作用5 min时活性差异仍然有统计学意义（P＜0.001），作用10 min时RhoA活性差异已无统计学意义。实验结果也证明，低浓度S1P（0.1μmol/L，0.5μmol/L，1.0μmol/L）刺激内皮细胞2-5 min时，RhoA活性与空白对照组相比，差异没有统计学意义(P＞0.05)。结果提示，只有高浓度S1P刺激导致RhoA活性的升高，生理浓度S1P刺激没有这个效应。
　　 (2)高浓度S1P介导RhoA活性增加的信号机制
　　 S1PR2拮抗剂JTE-013、细胞膜钙离子通道抑制剂钉红对高浓度S1P刺激的内皮细胞RhoA活性的影响:与空白对照组相比，先给予S1PR2拮抗剂JET-013刺激再给予高浓度S1P（10μmol/L）处理后，RhoA活性增高没有被抑制;先给予细胞膜钙离子通道抑制剂钉红刺激再给予高浓度S1P（10μmol/L）处理后，与单纯高浓度S1P处理组相比，RhoA活性的升高被明显抑制，差异有统计学意义(P＜0.001)。结果提示:高浓度S1P通过激活细胞膜钙离子通道介导RhoA活性的增加。本实验的结果显示，拮抗S1PR2的作用不影响高浓度S1P对RhoA的激活，我们推测在S1PR2/3介导RhoA活性增加的效应中，S1PR3可能起更重要的作用。
　　 研究通过使用S1PR1激动剂SEW2871、PI-PLC抑制剂ET-18-OCH3、IP3抑制剂2-APB，探讨了S1PR1-PI-PLC-IP3信号通路是否对高浓度S1P刺激的内皮细胞RhoA活性有影响。给予S1PR1激动剂SEW2871刺激内皮细胞后，RhoA活性没有明显增加;先给予PI-PLC抑制剂ET-18-OCH3刺激再给予高浓度10μmol/L S1P处理后，RhoA活性仍然明显增高(P＜0.001);先给予IP3抑制剂2-APB刺激再给予高浓度10μmol/L S1P处理后，RhoA活性也仍然明显增高（P＜0.001）。结果提示: S1PR1的激活及其下游通路PI-PLC和IP3与高浓度S1P介导的RhoA激活无关。
　　 2.S1P对内皮细胞ROCK磷酸化水平的影响
　　 (1) S1P以剂量依赖的方式引起HUVECs内ROCK磷酸化水平的增多
　　 在剂量效应组中，当低浓度S1P(0.1μmol/L，0.5μmol/L，1.0μmol/L)刺激内皮细胞时，与空白对照组相比，ROCK磷酸化水平的变化差异没有统计学意义(P＞0.05);当S1P浓度达到10μmol/L时，ROCK磷酸化水平升高，与对照组相比，差异具有统计学意义(P=0.009)。结果提示，高浓度S1P能引起内皮细胞ROCK磷酸化水平增高。
　　 (2)高浓度S1P增加内皮细胞ROCK磷酸化水平的机制
　　 与空白对照组相比，先给予S1PR2拮抗剂JET-013刺激再给予高浓度S1P(10μmol/L)处理后，ROCK磷酸化水平仍然明显增高(P=0.004);先给予钉红处理再给予高浓度S1P(10μmol/L)刺激后，ROCK磷酸化水平的升高被明显抑制，与单纯S1P(10μmol/L)处理组相比，差异有统计学意义（P=0.002）。先给予ROCK抑制剂Y-27632处理再给予高浓度S1P（10μmol/L）刺激后，ROCK磷酸化水平的升高也被明显抑制，与单纯S1P(10μmol/L)处理组相比，差异有统计学意义（P=0.008）。结果提示:细胞膜外钙内流是高浓度S1P导致ROCK磷酸化的机制之一;本实验的结果显示，拮抗S1PR2的作用不影响高浓度S1P增加ROCK磷酸化水平，推测在S1PR2/3介导RhoA活性和ROCK磷酸化的效应中，S1PR3可能起更重要的作用。
　　 本实验也探讨了S1PR1激动剂SEW2871，PI-PLC抑制剂ET-18-OCH3、IP3抑制剂2-APB是否对高浓度S1P介导的内皮细胞ROCK磷酸化水平升高有影响。给予S1PR1激动剂SEW2871刺激内皮细胞后，ROCK磷酸化水平没有明显增加;先给予PI-PLC抑制剂ET-18-OCH3刺激再给予高浓度S1P(10μmol/L)处理后，ROCK的磷酸化水平仍然明显增高（P＜0.001）;先给予IP3抑制剂2-APB刺激再给予高浓度S1P（10μmol/L）处理后，ROCK的磷酸化水平也仍然明显增高(P＜0.001)。结果提示:S1PR1的激活及其下游通路PI-PLC和IP3与高浓度S1P介导的ROCK磷酸化无关。
　　 3.S1P对磷酸化ROCK在细胞内分布的影响
　　 (1) S1P处理内皮细胞对磷酸化ROCK在细胞内分布的影响
　　 空白对照组中，内皮细胞的磷酸化ROCK主要较集中地分布在核周，胞浆中分布和含量都较少。当低浓度S1P（0.1μmol/L，0.5μmol/L，1.0μmol/L）刺激内皮细胞时，磷酸化ROCK的分布与空白对照组比较没有明显差异。当S1P浓度达到10μmol/L时，磷酸化ROCK在胞浆中的着色明显增加，分布增多而分散。结果提示高浓度S1P能引起ROCK的磷酸化激活，并且改变磷酸化ROCK在细胞中的分布。
　　 (2)高浓度S1P影响内皮细胞磷酸化ROCK分布的机制
　　 S1PR2拮抗剂JTE-013，ROCK抑制剂Y-27632，细胞膜钙离子通道抑制剂对高浓度S1P刺激的内皮细胞磷酸化ROCK在细胞内分布的影响
　　 与空白对照组相比，先给予S1PR2拮抗剂JET-013刺激再给予高浓度S1P(10μmol/L)处理后，磷酸化ROCK在细胞分布的变化与单纯给予高浓度S1P(10μmol/L)处理的细胞比较没有明显变化;先给予细胞膜钙离子通道抑制剂处理再给予高浓度S1P处理后，S1P介导的磷酸化ROCK的分布变化被明显抑制;先给予ROCK抑制剂Y-27632处理再给予高浓度S1P刺激后，S1P介导的磷酸化ROCK的分布变化也被明显抑制。结果提示:细胞膜外钙内流可能是高浓度S1P介导磷酸化ROCK分布变化的机制之一;本实验的结果显示，拮抗S1PR2的作用不影响高浓度S1P介导的磷酸化ROCK的细胞内分布，推测在S1PR2/3介导RhoA活性和ROCK磷酸化的效应中，S1PR3可能起更重要的作用。
　　 本实验也探讨了S1PR1激动剂SEW2871，PI-PLC抑制剂ET-18-OCH3、IP3抑制剂2-APB是否对高浓度S1P介导的内皮细胞磷酸化ROCK分布变化有影响。给予S1PR1激动剂SEW2871刺激内皮细胞后，磷酸化ROCK的分布了没有变化，着色没有明显增加;先给予PI-PLC抑制剂ET-18-OCH3或IP3抑制剂2-APB刺激，再给予高浓度S1P(10μmol/L)处理后，磷酸化ROCK的细胞内分布变化仍然出现，磷酸化ROCK水平仍然明显增高。结果提示:S1PR1的激活及其下游通路PI-PLC和IP3与高浓度S1P介导的内皮细胞磷酸化ROCK分布变化无关。
　　 结论:
　　 1.高浓度S1P(10μmol/L)刺激可以激活内皮细胞RhoA活性，增加ROCK的磷酸化水平，并改变磷酸化ROCK在内皮细胞的分布;生理浓度的S1P(0.1μmol/L，0.5μmol/L，1.0μmol/L)则没有此类效应。
　　 2.在本实验体系中，高浓度S1P(10μmol/L)可能不通过S1PR2，而是通过S1PR3激活RhoA/ROCK，改变磷酸化ROCK在细胞内的分布，细胞外盖内流参与了高浓度S1P介导RhoA/ROCK信号通路的激活。
　　 3.S1PR1的激活及其下游通路PI-PLC和IP3与高浓度S1P介导的内皮细胞RhoA活性增加和ROCK的磷酸化以及磷酸化ROCK在细胞内分布分变化无关。

目录

摘要

前言

材料与方法

1．1 一般实验材料及试剂的配置

1．2 实验仪器及设备

1．3 实验方法

1．4 实验分组

1．5 统计学处理

实验结果

1．S1P对内皮细胞RhoA活性的影响及其机制

2．S1P对内皮细胞ROCK磷酸化水平的影响

3．S1P对磷酸化ROCK在细胞内分布的影响

讨论

参考文献

英文缩略词

成果

致谢

声明

统计学审稿证明