重组色素上皮衍生因子对氧诱导大鼠视网膜新生血管生长的抑制作用

摘要

研究背景:
　　 早产儿视网膜病变（retinopathyofprematurity，ROP）已经成为全世界范围内致盲的重要原因，主要由于未成熟儿视网膜发育不完善，在多种因素影响下视网膜缺血，进一步造成视网膜新生血管形成，然后导致增殖性视网膜病变。视网膜新生血管形成后可发生渗出，出血，增殖膜等一系列病变，使眼球的结构和功能受到严重的损害。
　　 ROP的治疗主要是激光光凝术和冷冻手术，晚期的患者行玻璃体切割术，手术治疗虽然可控制ROP的病程，防止严重并发症，但治疗效果仍不理想，只是延缓病变的进展，在治疗过程中破坏了视网膜组织，导致视功能的永久性损害。
　　 ROP的发生与视网膜新生血管有密切关系。但新生血管增殖的机制不明，新生血管的形成是一及其复杂的生物过程。研究发现血管内皮生长因为与视网膜新生血管形成密切相关，视网膜新生血管性疾病均存在这视网膜组织血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor，VEGF)生成增加。而抑制视网膜组织VEGF的表达，能够使视网膜新生血管形成减少。VEGF作为一种血管生成刺激因子被认为在ROP血管形成中起到重要的中心调控作用，而色素上皮衍生因子（pigmentepithelium-derivedfactor，PEDF）是VEGF的非特异性抑制剂。两者在视网膜血管病变中有着密切的关系。在缺氧的视网膜中，PEDF的含量会下降，VEGF的含量增多。
　　 PEDF的产生和分布是很广泛的，成人眼内的PEDF存在于角膜，房水，玻璃体，视网膜等，主要由视网膜色素上皮分泌而来。PEDF不仅能够影响视网膜分化，发育和成熟，还有神经元保护作用，具有神经营养和抗新生血管的作用。PEDF是目前最强大的新生血管再生抑制因子之一。另外它只针对异常新生血管而不抑制正常存在血管，而且，PEDF的神经营养和保护作用，对比可能损害神经的抑制药物或生物因子来说，更占优势。因而PEDF具有广阔的临床应用前景。PEDF还具有抗氧化作用，这些因素都是早产儿视网膜病变的主要因素，所以可以想象PEDF在预防和治疗早产儿视网膜病变的新生血管形成及进展方面的作用。
　　 因此，我们的实验通过不同的氧气浓度建立合适的氧诱导视网膜病变(oxygeninducedretinopathy，OIR)模型，模拟人类未成熟儿视网膜病变，观察VEGF与视网膜新生血管之间的关系，采取PEDF两种不同的注射方式（结膜下、玻璃体腔）治疗，观察PEDF对视网膜新生血管的抑制作用及对正常视网膜血管的影响，力图寻找一种简便、安全、有效的途径，为未成熟儿视网膜病变药物治疗提供新的方法和思路。
　　 第一部分:不同吸氧浓度对新生鼠视网膜血管发育和血管内皮生长因子表达的影响
　　 目的:
　　 观察不同氧浓度环境在新生鼠视网膜病的作用，建立符合早产儿视网膜病变病理特点的动物模型，为研究该病的发病机制及治疗提供实验基础，利用视网膜血管ADP酶染色及组织切片观察大鼠视网膜形态及病变程度。分析新生鼠视网膜及氧诱导视网膜病变中VEGF蛋白质表达的变化。
　　 方法:
　　 将新生鼠40只，与母鼠共同饲养，将其分为空气组;波动组1:50％～20％;波动组2:40％～10％;波动组3:50％～10％四组，每组各10只。正常空气组正常空气中饲养18d，波动组1，放入50％O224h，20％24h，循环七次，共14d，后放入空气饲养4d，波动组240％O224h，10％24h，循环七次，共14d，后放入空气饲养4d，波动组3放入50％O224h，10％24h，循环七次，共14d，后放入空气饲养4d。18的时，每组各取6只大鼠左眼，行视网膜铺片ADP酶染色观察视网膜血管形态的发育，钟点法评价视网膜新生血管严重程度;每组各取6只大鼠右眼，制作眼球病理切片，常规HE染色计数突破视网膜内界膜的内皮细胞核定量分析视网膜新生血管增生情况，比较各组间的差异。各组剩余视网膜组织，利用Western-blot检测视网膜血管内皮生长因子VEGF蛋白的表达。
　　 统计分析:所有数据均依据SPSS13.0统计软件包进行分析，实验测试指标的数据资料以(x)±s表示;采用One-WayANOVA分析数据，方差齐时组间采用LSD法，方差不齐时组间多重比较采用DunnettC法，P＜0.05作为差异有显著性意义。
　　 结果:
　　 视网膜铺片ADP酶染色:正常空气组新生鼠在18d时视网膜血管发育基本成熟，管径较粗，全视网膜分深浅两层，浅层自视盘发出，向四周呈放射状均匀分布，深层呈多角形网状形态;波动组1视网膜血管发育基本正常;波动组2，3视网膜血管扩张迂曲，中央见无灌注区，血管发育未达视网膜周边部，有大量新生血管形成，血管密度增高，新生血管网结构紊乱，有新生血管丛和血管瘤。四组钟点法评价新生血管钟点数为:0，0.17±0.41,4.8±1.2，7.8±1.2，不同吸氧浓度导致的视网膜新生血管钟点数比较，差异有显著性意义(F=120.21，P=0.00);空气组波动组2，3病变钟点数明显增多，与相应的正常空气组相比较，差异有统计学意义(P=0.00);波动组1无明显增多，与正常空气组比较差异无统计学意义;波动组3比波动组2相比较增多，相比有统计学意义(P=0.00)。HE染色:四组突破内界膜内皮细胞核数分别为0.6±0.470.87±0.6514.28±3.8322.52±4.02，四组之间比较差异有显著性意义(F=875.366，P=0.00);正常空气组鼠几乎没有见到突破视网膜内界膜的血管内皮细胞核，波动组1切片中绝大多数视网膜内界膜是平滑的，偶见新生血管。波动组2，3组所有切片均可见较多突破内界膜的血管内皮细胞，所有切片均可见较多突破内界膜的血管内皮细胞，且波动3组突破内界膜的血管内皮细胞明显比波动2组多(P＜0.01);VEGF表达在所有波动组中，与波动组1,2比较，波动组3中VEGF表达最高，空气组表达最低。
　　 结论:
　　 1.50％～10％氧气波动组最适合制作早产儿视网膜病变模型，具有类似ROP血管闭塞，血管无灌注区，新生血管等改变，制备过程较为简便，重复性好，是研究ROP比较适合的动物模型;
　　 2.证实了反复血氧浓度波动可导致新生鼠视网膜新生血管增生性病变，吸入氧分压差(△FiO2)的波动与病变程度呈正相关;
　　 3.低氧比高氧对发生视网膜病变可能更重要;
　　 4.VEGF在视网膜新生血管形成中起着重要作用，促进视网膜新生血管形成。
　　 第二部分:结膜下和玻璃体注射重组人PEDF对氧诱导大鼠RNV的作用
　　 目的:
　　 观察结膜下和玻璃体注射重组人色素上皮衍生因子（pigmentepithelium-derivedfactor，PEDF）两种注射方式对氧诱导大鼠视网膜新生血管(Retinalneovascularization，RNV)的作用，从治疗角度阐述PEDF在ROP中的作用。
　　 方法:
　　 新生大鼠分别进行氧气或空气暴露:新生鼠与哺乳母鼠置于密闭容器内，50％O224h，10％/LO224h为1个循环，共7个循环，建立类似早产儿视网膜病变动物模型。氧诱导SD新生大鼠建立类似早产儿视网膜病变动物模型。新生鼠48只随机分为6组（A:空气对照组，B:高氧对照组，C:高氧+玻璃体注射PEDF2ug组，D:高氧+结膜下注射PEDF2ug组，E:高氧+结膜下注射PEDF4ug组，F:高氧+结膜下注射PEDF8ug组）。当新生大鼠脱离氧时，C，D，E和F组大鼠左眼用不同剂量和注药次数进行注射PEDF，共四天，18d处死取标本，ADP酶视网膜血管染色观察视网膜血管形态，石蜡切片计数突破视网膜内界膜的新生血管内皮细胞核数目。另新生大鼠2只进行左眼结膜下注射PEDF，Western-blot检测视网膜PEDF的表达.
　　 统计分析:所有数据均依据SPSS13.0统计软件包进行分析，实验测试指标的数据资料以(x)±s表示;采用One-WayANOVA分析数据，方差齐时组间比较采用Bonferroni法，方差不齐时组间多重比较采用DunnettC法，P＜0.05作为差异有显著性意义。P＜0.05为差异有统计学意义。
　　 结果:
　　 结膜下注射PEDF，可检测到视网膜PEDF蛋白表达;视网膜铺片结果:A组视网膜血管发育正常。B组视网膜大量的新生血管生成。C组新生血管明显减少。D、E、F组新生血管稍减少。六组组织病理学检测突破视网膜内界膜的新生血管内皮细胞计数分别为:1.88±0.92，25.00±0.94，12.23±0.96，24.58±1.03，23.68±0.77，23.20±0.88，各组比较差异有统计意义(F=6729，P=0.00);A组视网膜内界膜平滑，偶见突破的视网膜内皮细胞。B组明显高于A组(p=0.00)，差异有统计学意义。C组明显低于高氧对照组B组(p=0.00)，D组与B组相比无明显差异(p=0.20)，E、F组突破内界膜的内皮细胞核数与C组差异有统计学意义(p=0.00)。
　　 结论:
　　 1、结膜下注射PEDF，巩膜和脉络膜-色素上皮层对其是有渗透性的，可以跨越结膜下组织到达视网膜，但与玻璃体注射组相比，抑制新生血管作用有明显差异;
　　 2、玻璃体注射PEDF可以有效抑制氧诱导大鼠视网膜新生血管;
　　 3、结膜下注射PEDF如何有效到达视网膜还需进一步研究。

目录

摘要

前言

第一部分 不同吸氧浓度诱导视网膜病变大鼠模型

1 材料

2 实验方法

3 结果

4 讨论

5 参考文献

第二部分 PEDF抑制ROP新生血管形成的实验研究

1 材料

2 实验方法

3 结果

4 讨论

5 参考文献

全文总结与展望

附录一 缩略词表

攻读学位期间的研究成果

致谢

声明

统计学审稿证明