信号选择性甲状旁腺素模拟肽影响小鼠成骨细胞的基因表达谱分析

摘要

背景:
　　 自从Pommer在1885年提出骨质疏松以来，人们对骨质疏松的认识也随着历史的发展和技术的进步而逐渐深化。早年一般认为全身骨质减少即为骨质疏松，美国则认为老年骨折为骨质疏松。直到1990年在丹麦举行的第三届国际骨质疏松研讨会，以及1993年在香港举行的第四届国际骨质疏松研讨会上，骨质疏松才有一个明确的定义，并得到世界的公认:原发性骨质疏松是以骨量减少、骨的微观结构退化为特征的，致使骨的脆性增加以及易于发生骨折的一种全身性骨胳疾病，并拟定每年的10月20日为“国际骨质疏松日”。
　　 我国的骨质疏松流行病学调查发现，40岁以上的骨质疏松患病率为16.1％，随年龄增加，骨质疏松发生率递增，60岁以上人群22.6％，超过80岁时50％人群均有患病。随着人类社会的发展以及医疗水平和护理水平的提高，骨质疏松越来越成为临床护理和治疗的重点，同时我国也逐渐步入老龄化社会，由骨质疏松所带来的社会负担也逐渐增加，骨质疏松的机理研究和治疗已经成为一个热点。
　　 目前骨质疏松治疗的药物主要是抗骨吸收的药物，比如二磷酸盐、雌激素、降钙素denosumab（核因子KappaB配体的抗体）、odanacatib（破骨酶cathepsinK的抑制剂）、胰高血糖素样肽2等，以放缓骨吸收为主要目的，对骨量的增加有限。骨吸收抑制药使骨吸收量明显减少的同时，也使骨形成量轻度减少，既出现骨转化率（单位时间的骨重建量）减慢，同时呈现骨形成大于骨吸收，因此骨密度升高。但是抗骨吸收药物可能产生一些副作用，比如足量的2种骨吸收抑制药的联合用药，如果雌激素足量，联合Alendronate足量，骨形成作用降低，那么骨折愈合率降低，可能妨碍适量骨形成所保障的生理性微骨折的修复。
　　 PTH是体内重要的骨代谢调节激素，目前唯一临床可用的促进骨合成代谢的药物。天然的PTH由84个氨基酸构成，其N端34个氨基酸残基(PTH(1-34))具有同84个氨基酸相同的受体结合和受体激活功能，研究证实PTH(1-34)主要通过PKA和PKC两种信号途径发挥作用。随着对PTH信号通路研究的深入，发现PTHN端前两位氨基酸为PTH信号转导的关键性区域，第1位丝氨酸(Ser)突变成甘氨酸(Gly)可极大削弱PTH的PLC激活作用。19位谷氨酸突变成精氨酸(Arg)可以补偿29-34氨基酸残基缺失引起的受体结合力的减弱。实验证明G1R19(1-28)和G1R19(1-34)仅具有极小的PLC激活作用，G1R19(1-28)仅仅激活cAMP/PKA信号途径;G1R19(1-34)由于存在PTH(29-34)结构，除了激活cAMP/PKA信号途径，还能激活PKC（non-PLC/PKC信号途径）。三种肽可以增加小鼠远端股骨骨密度，并且PTH(1-34)和G1R19(1-34)增加股骨密度的量强于G1R19(1-28)。
　　 Wnt基因在胚胎发育、成人组织修复以及肿瘤的发生发面发挥着重要的作用，而近年来Wnt信号通路对骨骼系统，尤其是成骨细胞和软骨细胞的调节作用的研究逐渐增多。Wnt信号通路对调节骨量方面具有重要作用，研究证实PTH(1-84)可以通过激活Wnt信号传导通路来发挥成骨作用。那么PTH发挥成骨作用通过不同的信号途径，这些途径与Wnt信号通路之间存在什么样的关系，目前还没有见到相关研究的文献报道。
　　 目的：
　　 1.改进传统的酶消化法，通过Ⅰ型和Ⅱ型胶原酶消化获取成骨细胞，提供一种温和、高效的成骨细胞原代培养方法。
　　 2.本研究通过表达谱基因芯片技术，筛选信号选择性甲状旁腺素模拟肽成骨效应影响的差异基因，并且探索PTH成骨效应的不同信号通路与Wnt相关因子的关系，为阐明PTH成骨效应的机制提供理论基础。
　　 材料与方法：
　　 1.选择出生2d的C57BL乳鼠分离颅盖骨，利用Ⅰ型和Ⅱ型胶原酶，37℃震荡消化20min，弃去第一次上清，收集后四次上清液，加入10％FBS终止消化，2000rpm离心5分钟，弃上清后，接种于细胞培养瓶和六孔板中。取接种于6孔板中的原代成骨细胞进行鉴定:①ALP染色:培养14d时，取部分细胞，PBS冲洗3遍，按照ALP染色试剂盒说明行ALP染色，细胞质染成蓝色为阳性。②茜素红染色:取部分细胞加入成骨诱导液（10％FBS、50μg/mL维生素C、100mmol/Lβ-甘油磷酸钠），28d时以PBS冲洗2遍，4％多聚甲醛固定，0.1％茜素红37℃孵育30min，观察红色钙结节的形成。
　　 2.将贴壁生长的传一代细胞，PBS冲洗三遍，1％FBS维持培养12h，然后随机分成4组，分别接受10nMPTH(1-34)，10nMG1R19(1-34)，100nMG1R19(1-28)和等体积的0.1％TFA作用4h，利用Trizol法提取总RNA，送公司进行表达谱基因芯片分析，得到数据后，对数据进行挖掘，寻找三种模拟肽引起变化的Wnt相关因子，
　　 3.实时定量PCR法检验β-catenin、骨钙素(osteocalcin，OC)，以及筛选出的Wnt信号通路相关因子的变化（此步骤重复3次）。采用SPSS13.0统计软件包进行分析，数据以均数±标准差表示。组间均数比较时，如果方差齐性，则采用单因素方差分析，两两比较采用LSD检验，检验水准α=0.05，如果方差不齐时，采用Welch的修正值进行方差分析，两两比较采用Dunnett'sT3检验，检验水准α=0.05。数据统计完成之后，分析这些因子与PTH通路之间的关系。
　　 结果：
　　 1.培养一周后倒置显微镜观察，细胞形态不规则，呈多边形，三角形;培养14d，ALP染色观察显示胞质中出现蓝染的颗粒;诱导培养28d，茜素红钙结节染色发现红色点状或者片状钙沉积。
　　 2.通过基因芯片初步分析，得出信号选择性甲状旁腺素模拟肽对Wnt家族相关基因的影响:与空白对照组相比，G1R19(1-34)组Wnt2基因表达量下调2.045倍，Wnt5b基因表达量上调2.002倍，两者均参与癌症相关通路(Pathwaysincancer)，G1R19(1-28)组Wnt7b基因表达量下调2.438倍，参与癌症相关通路(Pathwaysincancer)。
　　 3.实时定量PCR检测发现，OC、Wnt5b表达水平处理组均高于空白对照组;Wnt2表达水平处理组均低于空白对照组;β-catenin表达水平PTH(1-34)处理组高于空白对照组;Wnt7b表达水平PTH(1-34)，G1R19(1-34)处理组高于空白对照组，且G1R19(1-34)组高于PTH(1-34)和G1R19(1-28)处理组，以上差异均有统计学意义(P＜0.05)，其余各因子mRNA表达两组比较差异无统计学意义(P＞0.05)
　　 结论：
　　 1.信号选择性甲状旁腺素模拟肽成骨效应引起变化的下游基因不同，差异基因富集的信号通路不同。
　　 2.在所检测的Wnt相关因子中，PTH(1-34)和G1R19(1-34)对经典Wnt信号因子作用明显，G1R19(1-28)对非经典Wnt信号因子作用明显。
　　 3.Wnt相关因子参与肿瘤发生发展的相关传导通路。

目录

摘要

前言

第一章 乳鼠原代成骨细胞分离培养及鉴定

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

第二章 PTH模拟肽影响小鼠成骨细胞的基因表达谱芯片分析

1 材料与方法

2 结果

3．讨论

第三章 PTH模拟肽成骨效应的Wnt信号通路研究

1．材料与方法

2．结果

3．讨论

参考文献

全文总结

综述

缩略词表

攻读学位期间成果

致谢

声明

统计学证明