复色1号方水提取物的作用机制及其外用制剂的初步研究

摘要

目的:
　　1.探讨复色1号方治疗白癜风的作用机制。
　　2.进行复色1号方酊剂及凝胶剂的制备。
　　3.考察复色1号方酊剂及凝胶剂的质量及经皮肤用药的安全性。
　　4.初步探查复色1号酊剂及凝胶的临床疗效。
　　方法:
　　1.采用四甲基偶氮唑蓝比色法（MTT法）测定0.001g/l、0.005g/l、0.01g/l、0.05g/l及0.1g/l1五种不同浓度的复色1号方水提取物培养的小鼠B16黑素瘤细胞吸光度值（A值），设单纯培养基作为对照组，以观察复色1号方水提取物对小鼠B16黑素瘤细胞增殖的影响;根据MTT实验结果，选取药物浓度，采用多巴速率氧化法测定0.001g/l、0.005g/l、0.01g/l三种不同浓度复色1号方水提取物在培养24小时、48小时及72小时后对细胞内酪氨酸酶活性的影响，设单纯培养基作为对照组，在酶标仪下测得各组A值。
　　2.以75％酊剂作为溶剂浸泡复色1号方，制成酊剂;以复色1号方水提取物为药物，卡波姆940为主要基质，PEG-4000及甘油作为吸湿剂及增稠剂，三乙醇胺为卡波姆的中和剂，月桂氮卓酮作为透皮剂，凯松作为防腐剂，按凝胶剂的制法制成凝胶剂。采用肉眼观察及离心的方法评价酊剂的外观、澄清度，采用室温储存方法观察酊剂的稳定性;采用自身涂布、肉眼观察及显微镜下观察的方法评价凝胶剂的外观及细腻度;采用恒温培养箱、冰箱、离心及室温贮存的方法考察凝胶的稳定性;用pH计测定复色1号方酊剂及凝胶剂的pH值。
　　3.选择FMMU豚鼠4只，Wistar大鼠40只。
　　①皮肤刺激试验:豚鼠4只，背部剃毛后按拉丁方设计方法，将豚鼠背部皮肤分为四个区域，每区2.0×2.0cm2大小，将酊剂组、凝胶组、酊剂对照（75％乙醇及0.16％月桂氮卓酮）和凝胶对照按设计方法涂在相应的皮肤上，酊剂以渗湿一层纱布为宜，凝胶涂0.lg/区为度，仔细、缓慢涂布，不得使药物流失。用一层保鲜膜覆盖保湿，再加纱布覆盖保护，最后用无刺激性胶布和绷带适当固定，以防止敷料脱落。每天受试药与对照物同时涂布1次，连续14天，每次涂抹后6小时，用温水洗去残留涂抹物。在每次去除涂抹物后1小时及再次涂抹前观察并记录涂抹部位红斑水肿情况及是否有色素沉着、出血点、皮肤粗糙或皮肤菲薄等情况，其发生及消退时间，并对红斑水肿进行评分，末次给药后去除受试物后1、24、48及72小时观察涂抹部位有无红斑和水肿等情况。
　　②皮肤变态反应试验:大鼠40只，随机分为5组，每组8只，第1组为复色酊剂组，第2组为凝胶组，第3组为阳性对照组（2，4一二硝基氯代苯），第4组为酊剂空白对照组（酊剂基质），第5组为凝胶空白对照组（凝胶的赋形剂）。每只大鼠每次涂药量为0.1g（酊剂以渗透1层纱布为度），致敏给药于大鼠的左侧皮肤进行，激发给药于大鼠的右侧皮肤进行。致敏给药:将受试物涂在各组大鼠左侧脱毛区，持续6小时后用温水擦去受试物，第7天和第14天以同样方法重复一次。阳性对照组用1％2，4—二硝基氯代苯溶液。激发给药:于末次给受试物致敏后14天，将受试物及对照物涂布于大鼠背部右侧脱毛区。阳性对照组用0.1％2，4—二硝基氯代苯溶液。6小时后温水擦去受试物，即刻观察，并于24小时、48小时和72小时重复观察涂抹部位有无红斑和水肿等过敏反应，并按评分标准对红斑和水肿进行评分。
　　4.观察临床上以复色1号酊剂及凝胶剂治疗的45例进展期白癜风患者的皮损，进一步考察此2种外用剂型经皮肤用药的刺激性及致敏性。节选2例典型病例说明此两种剂型联合内服药治疗白癜风的疗效和安全性，以肉眼观察皮损色素恢复作为疗效指标。
　　5.统计方法:以SPSS13.0统计软件对实验数据进行统计分析，计量资料以(i)土S表示，两组组间显著性检验用独立样本T检验;多组组间显著性检验用one-way Annova分析或协方差分析，多因素多水平显著性检验用析因分析资料的方差分析，组间多重比较采用bonferroni检验分析。当P＜0.05时，差异有统计学意义。
　　结果:
　　1.复色1号方水提取物在0.001～0.01g/l浓度范围内对小鼠B16黑素瘤细胞的增殖与对照组相比无统计学意义(P＞0.05)，0.05～0.1g/l对小鼠B16黑素瘤细胞的增殖与对照组相比有显著意义(P＜0.001)，呈现一定的抑制作用;在0.001g/l～0.1g/l浓度范围内，含药培养基组的A值（酪氨酸酶活性）与对照组比较均有显著性差异(F=2059.17，P＜0.001)，药物浓度越高，酪氨酸酶活性激活作用越明显;用药24、48及72小时之间A值有显著性差异(F=351.76，P＜0.001)，且随培养时间的延长，小鼠B16黑素瘤细胞中酪氨酸酶活性逐渐增强。
　　2.制备的酊剂澄清，紫褐色，澄清，有辛香及乙醇气味，浓度为相当于原生药的18％。制备的凝胶剂为棕褐色半透明膏体，色泽、质地均匀，外观细腻。酊剂样品离心后未见明显沉淀出现，pH计测得pH为6.15±0.005。酊剂样品在室温下放置1个月和3个月后酊剂的包装无变化，外观颜色澄清度均无明显变化。1个月后pH值为6.14±0.009，3月后测得pH为6.12±0.013。凝胶剂药物分散均匀，质地细腻，稠度适宜，易于涂布。常温贮存及耐寒耐热实验凝胶的外观、色泽及稠度无明显变化、无分层和变色现象，离心实验凝胶无变粗、分层和沉淀现象，pH值的平均值为5.96±0.012。放置4℃冰箱、室温后3个月再次检测pH值的平均值分别为5.94±0.011、5.93±0.013。
　　3.按皮肤刺激反应评分标准及刺激强度评分标准来判断，复色1号方酊剂及凝胶剂对豚鼠皮肤无红斑、水肿和脱屑等刺激反应;按皮肤变态反应评分标准和致敏率分类来判断，复色l号方酊剂及凝胶剂对大鼠皮肤无红斑、水肿等过敏反应，也未见哮喘、休克等严重的全身过敏反应。阳性对照组2，4—二硝基氯代苯致敏试验和激发试验期间所有大鼠均出现红斑和水肿，大鼠皮肤变态反应积分均为＞1，致敏率为100％。
　　4.临床上以复色1号酊剂及凝胶剂治疗的45例白癜风患者均未出现皮肤刺激及过敏反应。节选的2例白癜风患者均取得满意疗效，治疗过程中未出现红斑、水肿、水疱、苔藓样变及皮肤瘙痒等不良反应。
　　结论:
　　1.复色1号方水提取物对小鼠B16黑素瘤细胞内酪氨酸酶活性有明显的激活作用。通过促进酪氨酸酶活性以促进黑素合成，是复色1号方治疗白癜风的一个作用机制。复色1号方对小鼠B16黑素瘤细胞增殖无促进作用，且在高浓度对黑素瘤细胞的增殖呈抑制作用，表明促进黑素细胞的增殖可能不是本方治疗白癜风的作用机制。
　　2.按传统方法制成的复色1号方酊剂澄清。按我们研究设计出来的配方制备的复色1号方凝胶剂外观好看，质地细腻，稠度适宜，易于涂布。稳定性考察试验显示，酊剂与凝胶剂性状较稳定。酊剂pH值为6.15±0.005。室温下放置1月后pH值为6.14±0.009，3月后pH值6.12±0.013。凝胶的pH值为5.96±0.012，放置4℃冰箱、室温后3个月pH值的平均值分别为5.94±0.011、5.93±0.013。2种剂型均符合《中国药典》酊剂及凝胶剂项下有关的各项规定。
　　3.豚鼠的皮肤刺激试验及皮肤变态反应试验结果显示，复色1号酊剂及凝胶剂对豚鼠皮肤无刺激性;对大鼠皮肤无致敏性。经皮肤用药安全。
　　4.复色1号酊剂及凝胶临床应用安全性好，无明显皮肤刺激及致敏等不良反应。

目录

摘要

第一章 前言

第二章 复色1号方水提取物对小鼠B16黑素瘤细胞增殖及酪氨酸酶活性的影响

1 材料与仪器

2 实验方法

3 结果

4 分析与讨论

第三章 复色1号方酊剂及凝胶剂的制备及皮肤刺激试验

第一节 复色1号酊剂与凝胶剂的制备及质量考察

1 材料与仪器

2 实验方法

3 结果

4 讨论与分析

第二节 复色1号酊剂及凝胶剂的皮肤刺激性和皮肤变态反应试验

1 材料与仪器

2 实验方法

3 结果

4 讨论与分析

第四章 复色1号酊剂及凝胶治疗白癜风的临床安全性观察

第五章 全文总结

附图

参考文献

英文缩写词对照表

研究生期间成果

综述 白癜风中药外治法研究现状与展望

致谢

声明

统计学审稿证明